伍超，楊旭，陳樺，龔一波

糖尿病視網(wǎng)膜病變（DR）是Ⅱ型糖尿?。═2DM）的主要并發(fā)癥［1］，同時也是最常見的眼底病變［2］，起初形成微血管瘤，后期嚴重時可導(dǎo)致視網(wǎng)膜脫落而失明。因此，及早發(fā)現(xiàn)早期預(yù)警標志物并作出診斷對DR防控具有重要意義。miRNA是一類參與到機體細胞增殖、遷移和凋亡過程中的非編碼核酸小分子，并且有研究報道，miRNA 與眼科疾病的發(fā)展有密切聯(lián)系［3］。DR 后期就伴隨有新生血管和纖維增殖，miR-29c是miR-29家族中的一員，已被證實可參與細胞纖維化等病理過程［4］，提示miR-29c 可能與DR有關(guān)。有研究證明，miR-194在喉癌腎透明細胞癌、小細胞肺癌、胃癌等各種惡性疾病中表達異常［5］，T2DM 合并微量蛋白尿病人的尿液外泌體中，miR-194 表達量增高，表明miR-94 與糖尿病腎臟損傷有關(guān)［6］。但是關(guān)于miR-194在糖尿病病人眼底病變中作用尚未見研究，因此本研究從miR-29c、miR-194在DR病人血清中表達特點出發(fā)，研究其與病程的關(guān)系，現(xiàn)將結(jié)果總結(jié)如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2015 年6 至2017 年9 月漢中市人民醫(yī)院收治的DR病人98例為DR組，其中男性65 例，女性33 例，年齡范圍35～79 歲，年齡（65.07±7.68）歲，糖尿病病程范圍 4～27 年，病程（16.91±6.27）年。DR病人納入標準：（1）確診為糖尿病的病人，經(jīng)裸眼視力、矯正視力、眼壓、裂隙燈顯微鏡等眼科檢查，由眼科專業(yè)醫(yī)生確認為DR 病人；（2）年齡＞20 歲；（3）臨床資料完整；（4）入院前未接受過任何治療。排除標準：（1）合并心、肝、腎等臟器功能嚴重障礙者；（2）伴有急慢性感染性疾病、惡性腫瘤以及心腦血管疾病者；（3）存在精神疾病或交流溝通障礙者；（4）合并有糖尿病酮癥酸中毒、風濕結(jié)締組織病者；（5）合并白內(nèi)障、青光眼等其他眼部疾病病人。選取同期本醫(yī)院收治的T2DM 98例為DM組，其中男性 68 例，女性 30 例，年齡范圍 37～78 歲，年齡（65.13±6.26）歲，糖尿病病程范圍4～28年，病程（16.89±6.17）年。所有DM 病人都按照美國糖尿病學會頒布的糖尿病診斷標準（2010年）診斷糖尿?。海?）空腹血糖（FPG）≥7.0 mmol/L；（2）糖化血紅蛋白（HbA1c）≥6.5%；（3）口服耐糖實驗 2 h 血糖≥11.1 mmol/L。另以98 例同期在本院體檢健康者為空白對照組（NC 組）。各組間年齡及性別等一般資料比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），具有可比性。

本研究所有樣品采集均取得病人及家屬知情同意并簽字，符合《世界醫(yī)學協(xié)會赫爾辛基宣言》的相關(guān)要求。

1.2 主要試劑與儀器RNA提取試劑盒，購自于北京天根生化有限公司；AceQ qPCR SYBR? Green Mix，購自南京vazyme生物公司；引物，由上海生工生物公司等。qRT-PCR儀，購自美國Bio-Rad公司等。

1.3 研究方法

1.3.1血樣制備 使用無抗凝劑干燥試管采取病人空腹狀態(tài)靜脈血5 mL，4 000 r/min，離心10 min，之后12 000 r/min，離心15 min 后取上清液分裝于EP管中，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2臨床一般資料和生化檢測 測量病人的血壓、身高、體質(zhì)量、體質(zhì)量指數(shù)（BMI）。空腹10 h后，真空采血管采取肘靜脈血，全自動生化分析儀測定病人血液中三酰甘油（TG）、總膽固醇（TC）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDLC）和空腹血糖（FPG）和糖化血紅蛋白（HbA1c）。動脈硬化檢測裝置測踝肱指數(shù)（ABI）、脈搏波傳導(dǎo)速度（PWV）。

1.3.3實施熒光定量PCR 檢測miR-29c 與miR-194表達水平 采用RNA 提取試劑盒（天根）提取血清總RNA，反轉(zhuǎn)錄得cDNA。采用定量PCR 儀（Bio-Rad）對miR-29c和miR-194進行擴增。qRT-PCR 反應(yīng)體系共 10 μL：miScript SYBR?Green Mix 5 μL，cDNA（50 ng/μL）1 μL，上下游引物（10 μM）各0.5μL，雙蒸水（ddH2O）3.0 μL。反應(yīng)條件：95 ℃，90 s；95 ℃，30 s；63 ℃，30 s；72 ℃，15 s；40 個循環(huán)。miR-29c 和miR-194 及內(nèi)參U6 的引物序列見表1。采用2-ΔΔCT法對血清miR-29c和miR-miR-194表達水平進行定量分析。引物序列如表1所示。

表1 qRT-PCR引物序列

1.4 統(tǒng)計學方法利用SPSS 23.0 進行統(tǒng)計學分析，計數(shù)資料采用例（%）表示，行χ2檢驗；計量資料以±s 表示，行單因素方差分析；多因素logistic 回歸分析DR 發(fā)生的危險因素，相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 三組一般資料比較DR 組、DM 組和NC 組男女比例、年齡、病程、BMI、收縮壓（SBP）和舒張壓（DBP）比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表2。

2.2 三組血糖、血脂指標比較DR組、DM組和NC組TC、LDL-C、HDL-C、TG、ABI、PWV比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；DR組、DM組HbA1c、FPG水平顯著高于 NC 組，DR 組 HbA1c、FPG 水平顯著高于DM組（P＜0.05），見表3。

表2 糖尿病視網(wǎng)膜病變病人、Ⅱ型糖尿病病人、體檢健康者各98例一般資料比較

表3 糖尿病視網(wǎng)膜病變病人、Ⅱ型糖尿病病人、體檢健康者各98例臨床生化指標比較/±s

表3 糖尿病視網(wǎng)膜病變病人、Ⅱ型糖尿病病人、體檢健康者各98例臨床生化指標比較/±s

注：DR為糖尿病視網(wǎng)膜病變，T2DM為Ⅱ型糖尿病，NC為體檢健康者，BMI為體質(zhì)量指數(shù)，F(xiàn)PG為空腹血糖，HbA1c為糖化血紅蛋白，TC為總膽固醇，TG為三酰甘油，LDL-C為低密度脂蛋白膽固醇，HDL-C為高密度脂蛋白膽固醇，ABI為踝肱指數(shù)，PWV為脈搏波傳導(dǎo)速度

組別例數(shù)FPG/（mmol/L）HbA1c/%TC/（mmol/L）TG/（mmol/L）LDL-C/（mmol/L）HDL-C/（mmol/L）ABI左 右PWV/（cm/s）左 右NC組98 6.41±1.62 7.93±2.64 5.17±0.82 2.28±1.39 3.44±0.48 1.41±0.22 1.09±0.18 1.11±0.12 1 589.35±265.31 1 589.20±255.73 DR組98 9.41±1.76 9.40±1.61 5.35±1.34 2.29±1.46 2.96±1.58 1.39±0.34 1.11±0.10 1.12±0.14 1 635.24±245.33 1 630.25±238.01 DM組98 8.42±1.67 8.53±1.78 5.24±0.25 2.27±1.37 2.94±1.39 1.40±0.28 1.09±0.16 1.10±0.13 1 565.27±242.07 1 595.24±246.34 F值242.154 12.617 0.274 0.005 0.539 0.121 0.541 0.578 1.964 0.790 P值0.000 0.000 0.760 0.995 0.584 0.886 0.582 0.562 0.142 0.455

2.3 血清中miR-29c、miR-194表達量比較DR組和DM 組血清中miR-29c 表達水平明顯高于NC 組，DR 組血清中miR-29c 表達水平明顯高于DM 組（P＜0.05）；DR組和DM組血清中miR-194表達水平明顯低于NC 組；DR 組血清中miR-194 表達水平明顯低于DM組（P＜0.05）。見表4。

表4 糖尿病視網(wǎng)膜病變病人、Ⅱ型糖尿病病人、體檢健康者各98例血清中miR-29c、miR-194表達量比較/±s

表4 糖尿病視網(wǎng)膜病變病人、Ⅱ型糖尿病病人、體檢健康者各98例血清中miR-29c、miR-194表達量比較/±s

注：DR 為糖尿病視網(wǎng)膜病變，T2DM 為Ⅱ型糖尿病，NC 為體檢健康者，miR-29c 為微小 RNA-29c，miR-194 為微小RNA-194；與NC組比較，aP＜0.05；與DM組比較，bP＜0.05

組別NC 組DR 組DM 組F 值P 值例數(shù)98 98 98 miR-29c 1.01±0.10 1.29±0.57ab 1.12±0.25a 14.722 0.000 miR-194 1.02±0.11 0.67±0.85ab 0.75±0.21a 12.698 0.000

2.4 糖尿病視網(wǎng)膜病變病人血清中miR-29c、miR-194 表達量與血糖、血脂水平相關(guān)性分析糖尿病視網(wǎng)膜病變病人血清中miR-29c、miR-194相對表達量與TG、TC、LDL-C皆無相關(guān)性（P＞0.05），miR-29c相對表達量與FPG 和HbA1c 值呈正相關(guān)（P＜0.05），與 miR-194 相對表達量顯著負相關(guān)（P＜0.05）；miR-194 相對表達量與 FPG 和 HbA1c 值呈負相關(guān)（P＜0.05）。見表5。

表5 糖尿病視網(wǎng)膜病變98例血清miR-29c、miR-194相對表達量與生化指標相關(guān)性分析

表6 糖尿病視網(wǎng)膜病變98例多因素logistic回歸分析

2.5 糖尿病視網(wǎng)膜病變發(fā)生的多因素logistic 回歸分析對 DR 組和 DM 組的 FPG、HbA1c、miR-29c 和miR-194水平作為自變量，納入多因素logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)（表6），F(xiàn)PG 水平高、HbA1c 水平高、miR-29c水平高是DR發(fā)生的獨立危險因素（均P＜0.05），miR-194水平高是DR發(fā)生的保護因素（P＜0.05）。

3 討論

DR 是糖尿病常見并發(fā)癥中嚴重的致盲眼底病變［7］，DR 在初次確診 T2DM 中發(fā)生率為 12% 左右，在糖尿病病人中占50%，糖尿病的病程越長越容易發(fā)展為DR［8］，在發(fā)達國家已成為有勞動力人群致盲的首要原因。臨床上根據(jù)眼底是否有新生視網(wǎng)膜出現(xiàn)，將DR 分為增殖性視網(wǎng)膜病變和非增殖性性視網(wǎng)膜病變［9］，一旦進入增殖期，即使進行冷凝、光凝、玻璃體切割等治療，視網(wǎng)膜依舊受損且視力受損不可逆，嚴重影響病人生活質(zhì)量［10］。故盡早發(fā)現(xiàn)并確診十分重要，深入了解與DR 相關(guān)的因子及其在DR中的變化特點可以協(xié)助控制DR病情的發(fā)展。

miRNA 通過誘導(dǎo)細胞分化、觸發(fā)及調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)參與 DR 發(fā)生發(fā)展［11-12］。有研究表明，miRNA可通過抑制多個靶基因表達，調(diào)控糖尿病中多條相關(guān)信號通路，在糖尿病及其并發(fā)癥發(fā)展過程中起著重要作用。近幾年，研究報道m(xù)iRNA 與增生型DR病人增生膜活力存在明顯相關(guān)性，由此說明miRNA 在DR 的發(fā)生發(fā)展中扮演重要角色，但是miRNA 參與DR 的具體發(fā)病機制和生物學功能尚未明確。隨后，研究發(fā)現(xiàn)糖尿病病人血清中miR-29 表達紊亂，說明miR-29 可能與糖尿病及其多種并發(fā)癥發(fā)病過程有關(guān)［13］；吳心池等［14］研究證明在非增殖 DR 病人血清 miR-29c 表達上調(diào)；伍仙鳳等［15］研究證實，糖尿病大鼠視網(wǎng)膜組織中miR-29c 表達量升高，并推測其與新生血管有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，DR病人血清中miR-29c 表達水平顯著高于DM 組、NC組，DR 組病人血清中miR-29c 水平顯著高于DM組，與上述研究結(jié)果一致，提示miR-29c 可能與DR有關(guān)。進一步分析發(fā)現(xiàn)，DR 病人血清中miR-29c相對表達量與HbA1c、FPG 值呈正相關(guān)，提示DR 病人miR-29c 相對表達量可能通過影響DR 病人血糖代謝影響疾病嚴重程度。

有研究證實miR-194 可作為糖尿病發(fā)生的潛在生物標志物［16］。本研究發(fā)現(xiàn)，DR 組和 DM 組血清中miR-194 表達水平明顯低于NC 組，且DR 組血清中miR-194 表達水平明顯低于DM 組，與上述研究結(jié)果一致，提示miR-194 可能通過調(diào)控下游基因表達，調(diào)控DR 疾病發(fā)生與發(fā)展。趙旭東等［17］在其研究中發(fā)現(xiàn)DR 病人體內(nèi)出現(xiàn)明顯糖脂代謝紊亂現(xiàn)象。本研究發(fā)現(xiàn)DR 病人血清中miR-194 相對表達量與HbA1c、FPG 值呈負相關(guān)，且與miR-29c 表達量顯著負相關(guān)，提示miR-194、miR-29c 可能共同參與調(diào)解DR 病人血糖代謝。糖代謝紊亂是DR 發(fā)生的根本原因，吳心池等［18］研究發(fā)現(xiàn)，HbA1c 是DR 發(fā)病的獨立危險因子，靶基因預(yù)測也提示miR-29c 可靶向調(diào)控胰島素信號通路等參與血糖代謝。本研究通過多因素logistic 回歸分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)PG 水平高、HbA1c 水平高、miR-29c 水平高是DR 發(fā)生的獨立危險因素，miR-194 水平高是DR 發(fā)生的保護因素，提示 miR-29c 和 miR-194 可能通過調(diào)控糖代謝等途徑參與DR 病程。

但是，本研究樣本量較小，今后研究將擴大樣本量進一步確認，并通過生物信息學預(yù)測可能作用靶基因，進一步分析miR-29c和miR-194在DR疾病中具體作用機制。