張偉，趙衛(wèi)華，徐云興，王紅坡

梗阻性黃疸（Obstructive Jaundice，OJ）是指膽道系統(tǒng)發(fā)生梗阻后，導(dǎo)致膽紅素或游離膽紅素返流入血，并出現(xiàn)鞏膜黃染的現(xiàn)象［1-2］。王婷、許衛(wèi)娜［3］研究表明：持續(xù)性的OJ 對(duì)肝臟有較大的影響，嚴(yán)重會(huì)導(dǎo)致肝臟纖維化和肝硬化。目前使用中藥治療OJ效果較為突出［4］。中醫(yī)認(rèn)為黃疸濕熱結(jié)于脾胃，熏蒸肝膽，故治則不外清熱利濕［5］。茵陳五苓散中包含茵陳、澤瀉、茯苓片、豬苓、白術(shù)、桂枝等藥物，可以提高機(jī)體的抗氧化作用同時(shí)防止肝臟纖維化和肝炎。本研究旨在探究茵陳五苓散對(duì)實(shí)驗(yàn)性O(shè)J 大鼠肝損傷的保護(hù)作用及保護(hù)機(jī)理。

茵陳五苓散對(duì)實(shí)驗(yàn)性梗阻性黃疸大鼠肝損傷的保護(hù)作用

1 材料與儀器

1.1 動(dòng)物2017年1月至2019年5月，60只SPF級(jí)雄性SD 大鼠，購自廣東省醫(yī)學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，粵監(jiān)證字2004A029號(hào)，飼養(yǎng)溫度20～25 ℃，本研究經(jīng)過倫理委員會(huì)批準(zhǔn)且遵循動(dòng)物實(shí)驗(yàn)3-R原則。

1.2 藥物與試劑茵陳、澤瀉、茯苓片、豬苓、白術(shù)、桂枝，均購自武漢市中醫(yī)院；丙二醛（Malondialdehyde，MDA）試劑盒和超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）試劑盒購自江萊生物有限公司；B淋巴細(xì)胞瘤-2 蛋白（Bcl-2，貨號(hào) sc-56015，批號(hào)20181203）、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bax，貨號(hào)sc-20067，批號(hào)20190102）、半胱氨酸天門冬氨酸特異性蛋白酶（Caspase-3，貨號(hào)sc-56053，批號(hào)20190201）一抗購于美國Santa Cruz公司；鈣蛋白酶［Calpain，貨號(hào)EY-（K）-1003，批號(hào)12582012］一抗購自上海一研；HRP羊抗鼠IgG、HRP羊抗兔IgG購于美國Thermo公司。

1.3 儀器Sysmex-chemix-180 型全自動(dòng)生化分析儀購自日本Furuno Electric 公司；BS-124s 型電子天平購自北京賽多斯儀器系統(tǒng)有限公司；SG-51 正置型金相顯微鏡購自上海光學(xué)儀器廠；蛋白電泳及轉(zhuǎn)膜儀購自美國Bio-Rad 公司；凝膠成像系統(tǒng)購于以色列DNR 公司；LD-66 實(shí)驗(yàn)室切片機(jī)購自長沙益廣制藥機(jī)械公司。

2 方法

2.1 造模及藥物干預(yù)將60 只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為：對(duì)照組、模型組、低劑量茵陳五苓散組和高劑量茵陳五苓散組，每組各15 只；除對(duì)照組外各組大鼠制成實(shí)驗(yàn)性O(shè)J大鼠模型；造模具體方法參考韓德蘭等［6］研究。完成造模后12 h，低劑量茵陳五苓散組和高劑量茵陳五苓散組使用對(duì)應(yīng)濃度茵陳五苓散灌胃。茵陳五苓散組成：茵陳30 g、茯苓片15 g、豬苓15 g、白術(shù)15 g、桂枝10 g水煎；低劑量茵陳五苓散組灌胃劑量為10 g·kg-1·d-1；高劑量茵陳五苓散組灌胃劑量為20 g·kg-1·d-1；對(duì)照組和模型組使用等量生理鹽水灌胃，連續(xù)15 d。

2.2 檢測(cè)項(xiàng)目

2.2.1一般情況的觀察 藥物干預(yù)完成后立即稱大鼠體質(zhì)量，處死并檢測(cè)肝臟相關(guān)質(zhì)量計(jì)算肝指數(shù)。肝指數(shù)＝肝臟濕質(zhì)量/體質(zhì)量×100%。

2.2.2大鼠肝功能指標(biāo)檢測(cè) 各組大鼠眼球取血，按照檢測(cè)試劑盒說明書方法檢測(cè)各組大鼠丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、血清總膽紅素（TBIL）和內(nèi)毒素（ET）水平。

2.2.3大鼠氧化應(yīng)激指標(biāo)監(jiān)測(cè) 取大鼠肝組織，剪碎并使用胰蛋白酶制成勻漿，試劑盒說明書操作，檢測(cè)定大鼠肝組織中SOD、MDA含量水平。

2.2.4蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)蛋白表達(dá)水平 使用蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè) Bcl-2、Bax、Caspase-3 和鈣蛋白酶表達(dá)水平。取大鼠肝臟組織，使用胰蛋白酶消化后，提取總蛋白并轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上加入置脫脂奶粉室溫封閉，并加入稀釋后的Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白抗體，稀釋比例1：500，內(nèi)參蛋白實(shí)驗(yàn)β-actin，稀釋比例為1∶1 000，分析比較各目的蛋白與內(nèi)參蛋白條灰度，計(jì)算各蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法本研究數(shù)據(jù)分析采用軟件為SPSS 22.0，作圖采用軟件為GraphPad Prism 5，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法；若P＜0.05則表明差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 大鼠體質(zhì)量及肝指數(shù)檢測(cè)結(jié)果由表1 可以看出，相比對(duì)照組，模型組大鼠體質(zhì)量、肝指數(shù)顯著升高（P＜0.01）；相比模型組，低劑量茵陳五苓散組和高劑量茵陳五苓散組大鼠體質(zhì)量、肝指數(shù)顯著降低（P＜0.01），且高劑量茵陳五苓散組顯著低于低劑量茵陳五苓散組（P＜0.01）。

表1 大鼠60只體質(zhì)量及肝指數(shù)檢測(cè)結(jié)果/±s

表1 大鼠60只體質(zhì)量及肝指數(shù)檢測(cè)結(jié)果/±s

注：與對(duì)照組比較，aP＜0.01；與模型組比較，bP＜0.01；與低劑量茵陳五苓散組比較，cP＜0.01

組別對(duì)照組模型組低劑量茵陳五苓散組高劑量茵陳五苓散組鼠數(shù)15 15 15 15體質(zhì)量/g 385.22±38.21 485.78±55.54a 420.11±49.21b 398.79±39.99bc肝指數(shù)2.04±0.12 3.21±0.14a 2.53±0.17b 2.11±0.13bc

3.2 大鼠肝臟指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果相比空白對(duì)照組，模型組大鼠ALT、AST、TBILTBIL、ET水平均顯著升高（P＜0.01）；相比模型組，低劑量茵陳五苓散組和高劑量茵陳五苓散組大鼠ALT、AST、TBILTBIL、ET水平均顯著降低（P＜0.01），且高劑量茵陳五苓散組顯著低于低劑量茵陳五苓散組（P＜0.01）。見表2。

3.3 大鼠肝臟內(nèi)氧化物質(zhì)檢測(cè)結(jié)果相比空白對(duì)照組，模型組大鼠MDA 含量水平顯著升高（P＜0.01），SOD 水平顯著降低（P＜0.01）；相比模型組，低劑量茵陳五苓散組和高劑量茵陳五苓散組大鼠MDA 含量水平顯著降低（P＜0.01），且高劑量茵陳五苓散組顯著低于低劑量茵陳五苓散組（P＜0.01），SOD 水平顯著升高且高劑量茵陳五苓散組顯著高于低劑量茵陳五苓散組（P＜0.01）。見表3。

表2 大鼠60只肝臟指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果/±s

表2 大鼠60只肝臟指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果/±s

注：ALT 為丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶，AST 為天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶，TBIL 為血清總膽紅素，ET 為內(nèi)毒素。與對(duì)照組比較，aP＜0.01；與模型組比較，bP＜0.01；與低劑量茵陳五苓散組比較，cP＜0.01

組別對(duì)照組模型組低劑量茵陳五苓散組高劑量茵陳五苓散組鼠數(shù)15 15 15 15 ALT（U/L）72.30±7.21 212.02±30.00a 130.50±12.05b 93.15±10.25bc AST（U/L）42.30±8.20 200.15±42.40a 125.55±20.95b 83.47±12.27bc TBIL（μmol/L）9.31±1.30 188.58±20.10a 100.10±10.38b 72.30±10.25bc ET（EU/mL）0.33±0.03 0.77±0.03a 0.52±0.03b 0.40±0.03bc

表3 大鼠肝臟內(nèi)氧化物質(zhì)檢測(cè)結(jié)果/（U/mg，±s）

表3 大鼠肝臟內(nèi)氧化物質(zhì)檢測(cè)結(jié)果/（U/mg，±s）

注：MDA為丙二醛，SOD為超氧化物歧化酶。與對(duì)照組比較，aP＜0.01；與模型組比較，bP＜0.01；與低劑量茵陳五苓散組比較，cP＜0.01

組別對(duì)照組模型組低劑量茵陳五苓散組高劑量茵陳五苓散組鼠數(shù)15 15 15 15 MDA 8.31±2.10 19.00±4.20a 13.50±3.21b 9.26±2.20bc SOD 310.54±44.05 220.78±45.65a 200.47±27.15b 270.15±32.06bc

3.4 大鼠肝臟組織凋亡蛋白水平檢測(cè)結(jié)果相比空白對(duì)照組，模型組大鼠Bax 蛋白表達(dá)水平和Caspase-3 蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.01），Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.01）；相比模型組，低劑量茵陳五苓散組和高劑量茵陳五苓散組大鼠Bax 蛋白表達(dá)水平和Caspase-3 蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.01），且高劑量茵陳五苓散組顯著低于低劑量茵陳五苓散組（P＜0.01），Bcl-2 蛋白表達(dá)水平顯著升高且高劑量茵陳五苓散組顯著高于低劑量茵陳五苓散組（P＜0.01）。見圖1和表4。

表4 大鼠肝臟組織凋亡蛋白水平檢測(cè)結(jié)果/±s

表4 大鼠肝臟組織凋亡蛋白水平檢測(cè)結(jié)果/±s

注：Bcl-2為B淋巴細(xì)胞瘤-2蛋白，Bax為Bcl-2相關(guān)X蛋白，Caspase-3 為半胱氨酸天門冬氨酸特異性蛋白酶，β-actin 為β-肌動(dòng)蛋白。與對(duì)照組比較，aP＜0.01；與模型組比較，bP＜0.01；與低劑量茵陳五苓散組比較，cP＜0.01

組別對(duì)照組模型組低劑量茵陳五苓散組高劑量茵陳五苓散組鼠數(shù)15 15 15 15 Bcl-2/β-actin值1.45±0.21 0.45±0.10a 0.69±0.23b 0.75±0.10bc Bax/β-actin值0.25±0.09 1.39±0.21a 1.00±0.15b 0.90±0.11bc Caspase-3/β-actin值0.45±0.12 1.60±0.30a 1.20±0.20b 1.00±0.19bc

3.5 大鼠鈣蛋白酶蛋白表達(dá)水平檢測(cè)結(jié)果相比空白對(duì)照組，模型組大鼠鈣蛋白酶蛋白表達(dá)水平顯著升高P＜0.01）；相比模型組，低劑量茵陳五苓散組和高劑量茵陳五苓散組大鼠肝組織鈣蛋白酶蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.01），且高劑量茵陳五苓散組顯著低于低劑量茵陳五苓散組（P＜0.01）。見圖2和表5。

表5 大鼠鈣蛋白酶蛋白表達(dá)水平檢測(cè)結(jié)果/±s

表5 大鼠鈣蛋白酶蛋白表達(dá)水平檢測(cè)結(jié)果/±s

注：Calpain 為鈣蛋白酶，β-actin 為β-肌動(dòng)蛋白。與對(duì)照組比較，aP＜0.01；與模型組比較，bP＜0.01；與低劑量茵陳五苓散組比較，cP＜0.01

組別對(duì)照組模型組低劑量茵陳五苓散組高劑量茵陳五苓散組鼠數(shù)15 15 15 15 Calpain/β-actin值1.00±0.20 1.80±0.25a 0.75±0.15b 0.45±0.10bc

4 討論

肝臟損傷重要指標(biāo)包括：血清ALT、AST 活力等。黃新造等［7］研究表明：血清 ALT、AST 活力可以一定程度上反映肝臟受損程度。本研究中可以看出，相比模型組，使用茵陳五苓散處理的各組組大鼠ALT、AST 水平均顯著降低說明了茵陳五苓散可以有效降低肝細(xì)胞的受損程度。這可能是因?yàn)橐痍愇遘呱⒁砸痍悶榫?，配合澤瀉、豬苓具有清熱解毒利濕、健脾化濁之功，同時(shí)茵陳是利膽退黃的主藥，可以減輕肝細(xì)胞壞死的程度，促進(jìn)膽汁分泌降低血清中的ALT 及AST 水平。楊建橋、嚴(yán)清和［8］研究表明：茵陳五苓散可以降低ALT 及AST 水平，保護(hù)小鼠肝組織，本研究得出的結(jié)論與其相類似。

發(fā)生OJ 會(huì)使得腸粘膜屏障受到損害，使得大量的ET 會(huì)進(jìn)入血液，進(jìn)一步加重黏膜屏障的受損程度，并形成惡性循環(huán)［9］。TBIL是由體內(nèi)紅細(xì)胞裂解而釋放出的血紅蛋白產(chǎn)生的，主要包括間接膽紅素和直接膽紅素［10］。耿焱等［11］研究表明：檢查TBIL 含量水平不僅能反映肝臟損害的程度，尤其對(duì)黃疸的鑒別具有重要意義，膽汁淤積會(huì)引起黃疸，TBIL 含量水平顯著升高。本研究發(fā)現(xiàn)相比模型組，使用茵陳五苓散處理的各組大鼠TBIL 和ET水平均顯著降低說明了茵陳五苓散可以有效保護(hù)腸粘膜屏障。同時(shí)茵陳五苓散可以防止大量的膽酸及膽紅素淤積導(dǎo)致肝臟濕熱毒邪蘊(yùn)積，影響血?dú)膺\(yùn)行，從而造成肝細(xì)胞受損。王縛鯤等［12］研究表明：TBIL 是預(yù)測(cè)減黃效果的最佳指標(biāo)，降低其含量可有效緩解OJ，本研究得出的結(jié)論與其相類似。

隨著醫(yī)療的進(jìn)步，對(duì)活性氧的研究越來越深入，研究發(fā)現(xiàn)若發(fā)生氧化應(yīng)激反映會(huì)使得MDA的水平升高，同時(shí)自由基清除劑如SOD、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）等會(huì)嚴(yán)重減少或缺乏，同時(shí)還會(huì)影響細(xì)胞膜的通透性細(xì)胞內(nèi)的SOD、GSH-Px 等酶釋放至細(xì)胞外［13］。MDA 也是反應(yīng)體內(nèi)脂質(zhì)氧化的重要指標(biāo)［14］。本研究發(fā)現(xiàn)，相比模型組，使用茵陳五苓散處理的各組大鼠MDA含量水平顯著降低，SOD水平顯著升高，說明大鼠體內(nèi)的脂質(zhì)氧化受到了顯著的抑制，同時(shí)氧自由基也顯著減少，這可能是因?yàn)橐痍愇遘呱⒅邪能蜍咂?、白術(shù)等中藥具有抗氧化、清除自由基的效果。胡明華等［15］研究表明：降低自由基的含量水平可以有效保護(hù)OJ病人肝臟，本研究得出的結(jié)論與其相類似。

OJ 會(huì)損傷肝細(xì)胞，使得肝臟纖維化并促進(jìn)肝細(xì)胞的程序性死亡，細(xì)胞的凋亡受到基因的調(diào)控，其中Caspase 家族是細(xì)胞凋亡的核心。Caspase 家族中Caspase-3 和Caspase-9 是重要的凋亡基因，可以啟動(dòng)細(xì)胞的凋亡程序［16］。除了Caspase 家族蛋白可以調(diào)控細(xì)胞的凋亡，Bcl-2 家族蛋白也可以調(diào)控細(xì)胞的凋亡，在Bcl-2 家族中主要由Bcl-2 蛋白和Bax 蛋白分別抑制和促進(jìn)細(xì)胞的凋亡［18-20］。本研究發(fā)現(xiàn)，相比模型組，使用茵陳五苓散處理的各組大鼠Bax 蛋白表達(dá)水平和Caspase-3 蛋白表達(dá)水平均顯著降低，Bcl-2 蛋白表達(dá)水平顯著升高，說明使用茵陳五苓散處理后可以顯著降低大鼠肝臟細(xì)胞的凋亡，有效保護(hù)發(fā)生OJ 后的肝細(xì)胞。

鈣蛋白酶是一種降解蛋白的酶，會(huì)降解肌原纖維中的蛋白，在OJ 病人肝組織內(nèi)其表達(dá)會(huì)顯著增加，且與肝臟受損程度正相關(guān)［21］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，相比模型組，使用茵陳五苓散處理的各組大鼠肝組織鈣蛋白酶蛋白表達(dá)水平顯著降低，說明大鼠肝臟損傷得到了有效的緩解，這些可能和降低肝臟炎性細(xì)胞浸潤及成纖維細(xì)胞的增生有關(guān)。崔玉寶［21］研究表明：使用茵陳五苓散可以降低肝臟組織內(nèi)的鈣蛋白酶基因及蛋白的表達(dá)并促進(jìn)肝臟功能恢復(fù)。

綜上所述，茵陳五苓散可以有效保護(hù)實(shí)驗(yàn)性O(shè)J大鼠肝臟，其作用機(jī)制與抑制氧化應(yīng)激、鈣蛋白酶的表達(dá)及肝細(xì)胞的凋亡相關(guān)。但本研究使用的劑量梯度較少，在后續(xù)的研究中將進(jìn)一步探討茵陳五苓散的劑量對(duì)實(shí)驗(yàn)性O(shè)J大鼠肝臟保護(hù)的效果。

（本文圖1，2見插圖10-2）