李靜，王金銘，任琛琛，楊立，劉泇希，白楊

卵巢癌是常見(jiàn)的婦科惡性腫瘤，在卵巢腫瘤中它的發(fā)病率占50%～70%［1］。在早期，卵巢癌多無(wú)明顯表現(xiàn)，具有較高的病死率［1-2］。目前研究的主要理論認(rèn)為：細(xì)胞的過(guò)度增殖和侵襲力的異常參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展［2］，微小RNA（microRNA，miRNA）和卵巢癌的發(fā)生發(fā)展存在密切關(guān)系，通過(guò)對(duì)下游靶基因的調(diào)控表達(dá)，miRNA 影響了細(xì)胞的增殖和侵襲能力，可能導(dǎo)致卵巢癌的發(fā)生發(fā)展［3］。其中，miR-558 是目前被發(fā)現(xiàn)參與腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程的一種非常重要的新的癌基因，但是miR-558在卵巢癌組織中的表達(dá)以及miR-558 在卵巢癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用機(jī)制尚不明確，并且miR-558和叉頭框轉(zhuǎn)錄因子C1（FOXC1）之間的調(diào)控關(guān)系尚未見(jiàn)報(bào)道［4］。本研究主要探討miR-558 在卵巢癌組織中的表達(dá)情況、miR-558 與FOXC1 基因之間的調(diào)控關(guān)系和miR-558 對(duì)人卵巢癌腺癌細(xì)胞SKOV3 細(xì)胞增殖、侵襲能力的影響，在卵巢癌的發(fā)生機(jī)制及治療思路方面提供一些新的方向。

1 資料與方法

1.1 一般資料選擇2014年1月至2017年12月鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科同期收治的25 例上皮性卵巢癌、25例交界性卵巢上皮性腫瘤和25例良性卵巢上皮性腫瘤病人，經(jīng)過(guò)知情同意，取其手術(shù)切除的部分卵巢組織標(biāo)本；上皮性卵巢癌組年齡范圍為35～76 歲，臨床分期Ⅰ～Ⅱ期6 例、Ⅲ～Ⅳ期19 例，中高分化10例、低分化15例；交界性卵巢上皮性腫瘤組年齡范圍為39～65歲，臨床分期Ⅰ～Ⅱ期12例、Ⅲ～Ⅳ期13例，中高分化13例、低分化12例；良性卵巢上皮性腫瘤組年齡范圍為31～55歲。本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。病人對(duì)研究方案均簽署了知情同意書(shū)。由第四軍醫(yī)大學(xué)病原微生物學(xué)教研室惠贈(zèng)卵巢腺癌細(xì)胞系SKOV3細(xì)胞。

1.2 方法

1.2.1主要試劑 從廣州銳博科技有限公司購(gòu)買miR-558 的模擬物、抑制物及陰性對(duì)照。miR-558、小核RNA6（U6）的特異性引物、FOXC1 的引物由上海生工生物工程有限公司合成。β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）抗體、FOXC1 抗體購(gòu)買于美國(guó)Abcam 生物技術(shù)有限公司。實(shí)時(shí)熒光定量PCR 試劑盒購(gòu)買于北京鼎國(guó)公司產(chǎn)品。

1.2.2驗(yàn)證 miR-558對(duì)FOXC1基因的調(diào)控作用借助于權(quán)威的生物信息學(xué)靶基因預(yù)測(cè)網(wǎng)站（PicTar、mi-Randa 和 TargetScan），將 miR-558 的名稱和物種輸入，預(yù)測(cè)與miR-558相關(guān)的靶基因FOXC1；通過(guò)熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)，驗(yàn)證miR-558對(duì)FOXC1基因的靶向調(diào)控作用，構(gòu)建熒光素酶報(bào)告基因載體質(zhì)粒［（含有FOXC1 基因3’-非翻譯區(qū)（UTR）中潛在結(jié)合位點(diǎn)）］，野生型FOXC1基因3’-UTR（野生型-FOXC1-2-3’-UTR）和突變型FOXC1 基因3’-UTR（突變型-FOXC1-3’-UTR），放入-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩０奄|(zhì)粒和miR-558共同轉(zhuǎn)染到SKOV3細(xì)胞系中，培養(yǎng)48 h，用熒光素酶活性檢測(cè)試劑盒測(cè)定并計(jì)算海腎熒光素酶與螢火蟲(chóng)熒光素酶的比值，以此值表示細(xì)胞熒光素酶的水平。

1.2.3細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 在RPMI1640 培養(yǎng)基中（含1%青霉素及鏈霉素及10%胎牛血清）加入SKOV3 細(xì)胞，恒溫培養(yǎng)箱的溫度為37 ℃，含5%二氧化碳，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SKOV3 細(xì)胞；選取并計(jì)數(shù)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SKOV3 細(xì)胞，按照2.0×105個(gè)/孔接種到6 孔培養(yǎng)板中進(jìn)行培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染在細(xì)胞生長(zhǎng)態(tài)勢(shì)較好的時(shí)候進(jìn)行。將轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分成三組，分別為miR-558 模擬物組、miR-558 抑制物組及陰性對(duì)照組。將miRNA 轉(zhuǎn)染到SKOV3 細(xì)胞中，miRNA 由羧基熒光素（Carboxyfluorescein，F(xiàn)AM）標(biāo)記。轉(zhuǎn)染之前，充分混合miRNA 和轉(zhuǎn)染試劑，在室溫下放置5 min，然后放置到培養(yǎng)箱的細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，開(kāi)始轉(zhuǎn)染反應(yīng)；轉(zhuǎn)染24 h 以后，在200 倍光鏡及熒光顯微鏡下分別觀察并計(jì)數(shù)，把表達(dá)熒光蛋白的細(xì)胞作為陽(yáng)性細(xì)胞，計(jì)算其轉(zhuǎn)染效率，轉(zhuǎn)染效率為陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)與總細(xì)胞數(shù)的比值。

1.2.4實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)檢測(cè) 卵巢組織SKOV3 細(xì)胞中 miR-558 的表達(dá)水平以及 SKOV3 細(xì)胞中FOXC1 的mRNA 的表達(dá)水平將細(xì)胞的總RNA用Trizol一步法提取，濃縮，計(jì)算總RNA的純度和質(zhì)量。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)進(jìn)行試驗(yàn)后，行融解曲線分析，每個(gè)實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次。對(duì)結(jié)果采用2-△△ct法分析（ct值為反應(yīng)的實(shí)時(shí)熒光強(qiáng)度明顯大于背景值時(shí)的循環(huán)數(shù)）。

1.2.5蛋白印跡法檢測(cè) SKOV3 細(xì)胞中FOXC1 蛋白的表達(dá)水平提取總蛋白后測(cè)定濃度，依標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行凝膠電泳，封閉液進(jìn)行封閉，加入兔抗人FOXC1 一抗（1∶5 000 稀釋），在室溫下孵育2 h，然后洗滌3次，加入二抗，室溫下再孵育1 h，洗滌3次，把β-actin 作為內(nèi)參，分析其灰度值，計(jì)算FOXC1 蛋白的相對(duì)表達(dá)水平（FOXC1 蛋白與β-actin 的灰度值的比值）。該實(shí)驗(yàn)重復(fù)進(jìn)行3次。

1.2.6CCK-8 法檢測(cè) 轉(zhuǎn)染后SKOV3 細(xì)胞的增殖情況將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SKOV3 細(xì)胞接種于96 孔板中，在轉(zhuǎn)染后24、48、72、96 h，采用CCK-8 試劑盒來(lái)檢測(cè)細(xì)胞處于450 nm的吸光度（A）值并且記錄。計(jì)算細(xì)胞增殖率［（實(shí)驗(yàn)組A值-空白對(duì)照組A值）/（對(duì)照組組A 值-空白對(duì)照組A 值）×100%］。本實(shí)驗(yàn)重復(fù)進(jìn)行3次。

1.2.7基質(zhì)膠侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè) 轉(zhuǎn)染后SKOV3 細(xì)胞的侵襲力將轉(zhuǎn)染后24 h的SKOV3細(xì)胞進(jìn)行收集，細(xì)胞懸液加入到穿膜小室內(nèi)，培養(yǎng)36 h，取出小室，擦拭掉上室細(xì)胞，把那些已經(jīng)侵入并且貼附于下層微孔膜的細(xì)胞用多聚甲醛固定5 min，磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗后在顯微鏡下觀察，隨機(jī)在每張微孔膜中選5個(gè)視野進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。此實(shí)驗(yàn)重復(fù)進(jìn)行3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法使用SPSS 21.0 軟件包對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料用±s 來(lái)表示，所有數(shù)據(jù)均進(jìn)行正態(tài)檢驗(yàn)并且符合正態(tài)分布，采用單因素方差分析進(jìn)行多組間的比較，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)對(duì)兩組間進(jìn)行比較。P＜0.05 時(shí)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 驗(yàn)證miR-558對(duì)FOXC1基因的靶向調(diào)節(jié)作用上述3個(gè)權(quán)威的生物信息學(xué)靶基因預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)得出miR-558的靶基因是FOXC1，熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)顯示，含有miR-558的質(zhì)粒以及含有FOXC1基因的重組質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染SKOV3細(xì)胞后，模擬物組熒光素酶相對(duì)活性為（0.56±0.01），陰性對(duì)照組熒光素酶相對(duì)活性為（1.12±0.02），與陰性對(duì)照組相比較，模擬物組的熒光素酶活性下降了49.50%（P＜0.05）。

2.2 卵巢組織中的miR-558 的相對(duì)表達(dá)水平比較實(shí)時(shí)熒光定量-PCR技術(shù)結(jié)果顯示，上皮性卵巢癌、交界性卵巢上皮性腫瘤和良性卵巢上皮性腫瘤病人卵巢組織中miR-558 的相對(duì)表達(dá)水平分別為（3.43±0.42）、（2.47±0.35）、（1.37±0.31)，各組之間兩兩比較，均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。

實(shí)時(shí)熒光定量-PCR技術(shù)的結(jié)果顯示，在miR-558模擬物組、抑制物組和陰性對(duì)照組中，SKOV3 細(xì)胞miR-558 的表達(dá)水平分別為（2.37±0.17）、（0.64±0.17）、（1.14±0.11），miR-558各組間兩兩比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；在miR-558模擬物組、抑制物組和陰性對(duì)照組中，SKOV3細(xì)胞的FOXC1基因轉(zhuǎn)錄出的mRNA的表達(dá)水平分別為（0.51±0.10）、（2.27±0.12）、（0.99±0.11），F(xiàn)OXC1的mRNA表達(dá)水平各組間兩兩比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。

蛋白印跡法結(jié)果顯示，在miR-558模擬物組、抑制物組和陰性對(duì)照組SKOV3細(xì)胞中，F(xiàn)OXC1蛋白的表達(dá)水平分別為（0.83±0.07）、（2.17±0.15）、（1.47±0.21），F(xiàn)OXC1 蛋白的表達(dá)水平各組間兩兩比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。

CCK-8 結(jié)果顯示，miR-558 模擬物組的細(xì)胞增殖率顯著高于陰性對(duì)照組，抑制物組細(xì)胞的細(xì)胞增殖率明顯低于陰性對(duì)照組，模擬物組中增殖率水平高于抑制物組，各組間兩兩比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見(jiàn)圖1。

圖1 卵巢癌組織CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果

基質(zhì)膠侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在miR-558 模擬物組、抑制物組和陰性對(duì)照組SKOV3 細(xì)胞中，SKOV3細(xì)胞穿透基底膜的細(xì)胞數(shù)分別為（158.33±9.45）、（67.01±10.58）、（117.67±16.86）（P＜0.05）。miR-558細(xì)胞侵襲力水平各組間兩兩比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。

3 討論

卵巢癌的發(fā)病率位居女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤的前3 位，而它的死亡率卻位居?jì)D科惡性腫瘤之首［1］。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，2015年，我國(guó)大約有5萬(wàn)多名女性被確診為卵巢癌，約3 萬(wàn)例病人死于卵巢癌［1-2］。腫瘤細(xì)胞異常的增殖和侵襲能力是惡性腫瘤的主要生物學(xué)特征，細(xì)胞的增殖和侵襲能力是影響癌癥治療和預(yù)后的重要因素。腫瘤細(xì)胞異常的增殖力與侵襲力相互作用，共同促進(jìn)癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，最終導(dǎo)致癌癥的發(fā)展轉(zhuǎn)移和化療耐藥［1，5-7］。因此，明確卵巢癌細(xì)胞增殖和侵襲能力過(guò)度的具體原因?qū)刂坡殉舶┑陌l(fā)生發(fā)展具有重大意義。腺癌是卵巢上皮性癌中的主要病理類型，本研究所選用的SKOV3 細(xì)胞系是卵巢腺癌細(xì)胞系能夠更為真實(shí)地反映卵巢癌的生物學(xué)特性。

miRNA 是小分子單鏈 RNA，由 21 至 23 個(gè)核苷酸組成，位于內(nèi)源非編碼區(qū)，通過(guò)與靶mRNA 特異性的堿基配對(duì)，將靶mRNA 降解，或者抑制它的翻譯，繼而實(shí)現(xiàn)對(duì)目的基因的調(diào)控［3］。miR-558 是miRNA 中的一種，位于人類2 號(hào)染色體p22.3，能夠調(diào)節(jié)環(huán)氧合酶2和白細(xì)胞介素-1β的表達(dá)，誘導(dǎo)人關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞分解代謝［4］。有研究表明，miR-558可通過(guò)調(diào)控細(xì)胞的凋亡、增殖以及細(xì)胞的遷移、侵襲等生物學(xué)行為從而參與腫瘤的進(jìn)展，如胃癌、成神經(jīng)細(xì)胞瘤［8，10］。Li Y等［9］通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，在膀胱癌病人體 內(nèi) ，環(huán) 狀 RNAHIPK3（circHIPK3）是 低 表 達(dá)的，circHIPK3 能夠抑制miR-558 的表達(dá)水平，降低乙酰肝素酶的表達(dá)，從而調(diào)控細(xì)胞的遷移和侵襲及膀胱癌的血管生成，由此提示我們，miR-558能夠促進(jìn)膀胱癌的腫瘤發(fā)生。華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院的 Qu H 教授團(tuán)隊(duì)［10］通過(guò)研究發(fā)現(xiàn) miR-558 能夠與缺氧誘導(dǎo)因子2的5’-非編碼區(qū)結(jié)合，促進(jìn)缺氧誘導(dǎo)因子2 的表達(dá)從而促進(jìn)成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、遷移、侵襲和血管生成，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生，研究表明，高表達(dá)miR-558 的病人生存預(yù)后較差。同時(shí)Qu H教授團(tuán)隊(duì)［11］也在成神經(jīng)細(xì)胞瘤的細(xì)胞中，通過(guò)敲除內(nèi)源性miR-558 的表達(dá)，證實(shí)其能夠通過(guò)活化乙酰肝素酶促進(jìn)成神經(jīng)細(xì)胞瘤的腫瘤生成和侵襲。華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院的Zheng L 教授團(tuán)隊(duì)［8］發(fā)現(xiàn)在胃癌的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)和體外實(shí)驗(yàn)中，miR-558 能夠識(shí)別乙酰肝素酶啟動(dòng)子中的互補(bǔ)位點(diǎn)，以AGO蛋白家族成員1（Argonaute 1）依賴的方式結(jié)合SMAD 家族成員4（Smad4）降低Smad4的表達(dá)，從而促進(jìn)胃癌的進(jìn)展。這些研究與我們的結(jié)果相一致，從而更加明確了miR-558的致癌作用。

FOXC1 基因長(zhǎng)約1787kb，位于人類6 號(hào)染色體p25.3，經(jīng)轉(zhuǎn)錄翻譯形成FOXC1 蛋白。最新的研究表明，F(xiàn)OXC1通過(guò)激活趨化因子受體4（CXCR4），能夠參與癌癥的發(fā)生發(fā)展，并且能夠與活化T-細(xì)胞核因子1（NFATC1）構(gòu)成基因遺傳軸參與疾病的發(fā)展［12］。本課題組的前期研究已經(jīng)通過(guò)QRT-PCR 技術(shù)和免疫組化法分析上皮性卵巢癌、交界性卵巢上皮性腫瘤和良性卵巢上皮性腫瘤病人的卵巢組織，明確在上皮性卵巢癌中FOXC1 的表達(dá)水平是降低的，與本次研究中的miR-558 的表達(dá)水平呈負(fù)向相關(guān)性［13-14］。同時(shí)本研究我們通過(guò)分析miRNA 靶基因預(yù)測(cè)（PicTar、miRanda 和TargetScan）數(shù)據(jù)庫(kù)和熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)明確了miR-558 對(duì)FOXC1 的靶向調(diào)控作用。本課題組通過(guò)前期研究發(fā)現(xiàn)在重組FOXC1慢病毒表達(dá)穩(wěn)定的SKOV3的細(xì)胞中，細(xì)胞的增殖和侵襲能力受到明顯抑制，在本次研究中我們進(jìn)一步通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)明確了FOXC1 對(duì)卵巢癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力的抑制作用是由miR-558 對(duì)FOXC1的靶向調(diào)控實(shí)現(xiàn)的［15］。

綜上所述，miR-558 通過(guò)靶向調(diào)控FOXC1 的表達(dá)，能夠促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力，這為卵巢癌的發(fā)病機(jī)制提供了重要的理論依據(jù)。但是miR-558在卵巢癌病人血清中的具體表達(dá)情況以及在卵巢癌裸鼠移植瘤動(dòng)物模型中的具體作用尚不明確，且與卵巢癌病人生存預(yù)后之間的關(guān)系尚不清楚，這仍然是本課題組下一步要深入研究的重點(diǎn)。