趙謙，白艷霞，張少強，李宏慧，姚小寶，戴皓，邵淵

喉鱗狀細胞癌是頭頸部常見的惡性腫瘤，發(fā)病率高居所有頭頸部鱗狀細胞癌的第二位［1］。近年來，隨著早期診斷及治療手段的大幅進步，多種腫瘤相關(guān)致死率逐年下降［2-3］。但是，喉鱗狀細胞癌病人的死亡率卻無顯著改善［4-5］。喉鱗狀細胞癌的復(fù)發(fā)及進展是一個多因素、多階段的過程，其病因涉及環(huán)境及基因等多方面原因。然而，喉鱗狀細胞癌發(fā)生及進展的潛在分子機制研究成果較少。因此，鑒定喉鱗狀細胞癌診斷及判斷預(yù)后分子標(biāo)志物，探索其余臨床治療及預(yù)后的相關(guān)性具有很高的價值。N-myc下游調(diào)控基因 2（N-myc，downstream regulated gene 2，NDRG2）近年來在國內(nèi)首次克隆并報道并確定為潛在的抑癌分子［6］，NDRG2的過表達可顯著抑制多種腫瘤細胞的增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移能力［7-8］。但是截至目前，NDRG2在喉鱗狀細胞癌細胞的生物學(xué)特性尚無報道。本研究擬應(yīng)用體內(nèi)及體外實驗的方法來研究NDRG2對喉鱗狀細胞癌發(fā)生、發(fā)展的相關(guān)性。

N-myc 下游調(diào)控基因2 蛋白在喉鱗狀細胞癌中的表達及對人喉表皮樣癌細胞生物學(xué)特性的影響

圖1 N-myc下游調(diào)控基因2（NDRG2）在癌旁組織（1A、1B）及喉鱗狀細胞癌（1C、1D）中的表達（HE×200）：1A、1C為陰性，1B、1D為陽性圖4 N-myc下游調(diào)控基因2（NDRG2）抑制Hep-2細胞轉(zhuǎn)移能力（HE×200）：4A為對照組，4B為NDRG2抑制喉鱗狀細胞癌轉(zhuǎn)移圖5 N-myc下游調(diào)控基因2（NDRG2）抑制Hep-2細胞侵襲能力（HE×200）：5A為對照組，5B為NDRG2抑制喉鱗狀細胞癌侵襲插圖10-1

1 材料與方法

1.1 一般材料

1.1.1臨床標(biāo)本 41 例喉鱗狀細胞癌組織及癌旁組織于2014年1月1日至2017年12月31日在西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院接受喉部分切除術(shù)的病人，其中男性37例，女性4例，年齡范圍52～78歲，中位年齡63.7 歲。按TNM 分期，T1 有15 例（36.6%），T2有 12 例（29.3%），T3 有 10 例（24.4%），T4 有 4 例（9.8%）。組織標(biāo)本切除后經(jīng)4%多聚甲醛固定24 h，常規(guī)石蠟包埋、切片、儲存于西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科。本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會赫爾辛基宣言》關(guān)要求。

1.1.2實驗試劑及儀器 免疫組化染色試劑盒購自福州邁新科技有限公司，QPCR 試劑盒購自日本TAKARA 公司，DEME 培養(yǎng)基購自美國 Gibco 公司，胎牛血清購自北京賽澳美細胞技術(shù)有限公司，兔抗人NDRG2抗體購自英國Abcam公司，羊抗兔二抗購自美國CST公司，NDRG2過表達慢病毒由上海吉凱科技有限公司設(shè)計并包裝，Transwell 小室購自美國Millipore公司，基質(zhì)膠購自美國BD公司。

1.2 方法

1.2.1免疫組化染色（Immunohistochemestry，IHC）喉鱗狀細胞癌及癌旁組織石蠟切片常規(guī)脫蠟，高壓抗原修復(fù)，3%過氧化氫阻斷非特異性過氧化物酶，5%非免疫血清封閉，兔抗人NDRG2抗體一抗4 ℃孵育過夜，PBS清洗三次后，羊抗兔二抗室溫避光孵育20 min，PBS清洗三次后，鏈霉菌抗生物素-過氧化酶染色20 min，PBS 清洗三次后，DAB 顯色，蘇木素復(fù)染，PBS 反藍，水性封片劑封片，顯微鏡拍照檢測。免疫組化評分根據(jù)染色強度及陽性染色范圍進行綜合評估。染色強度為藍色計0分，淡黃色計1分，黃色計2 分，棕褐色計3 分。陽性染色范圍5%～25%計1 分，26%～50%計2 分，51%～75%計3 分，76%～100%計4 分。兩者乘積大于等于4 分判定為NDRG2陽性，乘積小于4分判定為NDRG2陰性。

1.2.2實時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Quantitative realtime Polymerase Chain Reaction，QPCR）配置QPCR反應(yīng)液：10 xbuffer 2μL，NDRG2或β-actin正義鏈引物1μL，NDRG2或β-actin反義鏈引物1μL，反轉(zhuǎn)錄模板2 μL，去離子水14 μL。程序設(shè)定為預(yù)變性95 ℃ 2 min；變性 94 ℃ 30 s，退火 60 ℃ 15 s，延伸72 ℃，35 個循環(huán)；4 ℃。NDRG2 正向引物序列：5’-GCCCAGCGATCCTTACCTACC-3’，NDRG2 反向引物序列：5’-GGCTGCCCAATCCATCCAACC-3’；β-actin正向引物序列：5’-CGTCTTCCCCTCCATCGT-3’；β-actin 反向引物序列：5’-GAAGGTGTGGTGCCAGATTT-3’。

1.2.3細胞培養(yǎng)及慢病毒感染 喉鱗狀細胞癌Hep-2細胞及正常鼻咽上皮NP-69細胞購自于上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司，培養(yǎng)基為10%胎牛血清的DEME培養(yǎng)液，細胞孵箱條件設(shè)置為：37 ℃，5%二氧化碳濃度。細胞鋪6孔板，匯合度至40%左右時，行慢病毒感染實驗。更換為1 mL無血清培養(yǎng)液，加入2μL NDRG2過表達或?qū)φ詹《炯?μLEnhanced Infection Solution，感染12 h后更換為完全培養(yǎng)基。72 h后行Transwell檢測兩組細胞侵襲及轉(zhuǎn)移能力的差異。

1.2.4蛋白質(zhì)印跡法（Western Blot）提取感染NDRG2過表達及對照慢病毒組細胞蛋白，蛋白定量后，添加6x上樣緩沖液，煮沸5 min，每孔加20μg蛋白樣品。跑膠，電泳條件設(shè)定為恒壓110 V，時間70 min。轉(zhuǎn)膜至PVDF 膜，轉(zhuǎn)膜條件設(shè)定為恒流300 mV，時間70 min。5%BSA 孵育 1 h，兔抗人NDRG2一抗（1∶800 稀釋）4 ℃過夜孵育，TBST 清洗3 次后，羊抗兔二抗（1∶5 000稀釋）室溫孵育1 h，TBST清洗三次后，化學(xué)發(fā)光，拍照。

1.2.5Transwell 無血清培養(yǎng)基重懸感染 NDRG2過表達及對照病毒的Hep-2細胞，接種200μL共計60 000 個細胞至Transwell 小孔，每組設(shè)3 個副孔。其中細胞侵襲實驗所用Transwell 小孔預(yù)先包被基質(zhì)膠，細胞轉(zhuǎn)移試驗所用Transwell 小孔無需預(yù)先處理。將小室置于已加入600 μL 20%血清濃度DMEM培養(yǎng)基的24孔板中。24 h后，無水甲醇固定10 min，PBS清洗后，0.1%結(jié)晶紫染色10 min，PBS清洗，顯微鏡下拍照。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 22.0軟件包進行分析。計量資料以±s表示，兩組間差異分析采用獨立樣本雙側(cè)t檢驗；不同臨床病理特征分組間NDRG2 陽性率差異分析采用χ2檢驗；P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NDRG2在喉鱗狀細胞癌組織中的表達如圖1所示，喉鱗狀細胞癌及癌旁組織中NDRG2免疫組化陽性染色主要定位于細胞質(zhì)，伴輕微胞核和胞膜陽性染色。41例喉鱗狀細胞癌組織中NDRG2陽性率為24.39%（10/41），癌旁組織中NDRG2陽性率為85.37%（35/41），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=30.781，P=0.001）。

表1 N-myc下游調(diào)控基因2（NDRG2）陽性率在不同臨床病理特征比較/例（%）

2.2 NDRG2 與喉鱗狀細胞癌臨床病理特征的關(guān)系卡方分析顯示TNM III 和V 期喉鱗狀細胞癌的NDRG2陽性率顯著低于TNM I 和II期病人，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移喉鱗狀細胞癌病人中NDRG2 陽性率亦低于未發(fā)生轉(zhuǎn)移病人（P＜0.05，表1）。其他臨床病理特征分組間NDRG2 陽性率差異無統(tǒng)計意義。以上結(jié)果提示NDRG2可能參與抑制喉鱗狀細胞癌淋巴轉(zhuǎn)移。

2.3 NDRG2在Hep-2細胞中的表達QPCR及WB結(jié)果顯示NDRG2 mRNA 及蛋白在喉鱗狀細胞癌Hep-2細胞中的表達水平為1.193±0.053明顯低于正常鼻咽上皮NP-69 細胞（0.238±0.072）（t=3.536，P=0.036）。提示NDRG2 可能在喉鱗狀細胞癌中扮演抑癌分子的角色。見圖2。

圖2 NDRG2在喉鱗狀細胞癌Hep-2細胞中的表達

2.4 NDRG2 過表達慢病毒對NDRG2 表達的影響為了檢測NDRG2對Hep-2細胞侵襲及轉(zhuǎn)移的影響，我們包裝了NDRG2 慢病毒。QPCR 及WB 結(jié)果顯示感染NDRG2慢病毒的Hep-2細胞（1.046±0.048）中NDRG2 mRNA 及蛋白表達水平較感染對照病毒的Hep-2細胞（5.878±0.483）均明顯升高（t=4.825，P=0.017），見圖3。

圖3 NDRG2慢病毒可上調(diào)Hep-2細胞中NDRG2表達

2.5 NDRG2對Hep-2細胞轉(zhuǎn)移能力的影響Transwell 實驗結(jié)果顯示，感染NDRG2 過表達慢病毒組轉(zhuǎn)移細胞數(shù)目明顯低于感染對照病毒組［Lv-control（141.328±23.424）個，Lv-NDRG2（54.925±16.825）個；t=4.413，P=0.023］，提示NDRG2 可抑制喉鱗狀細胞癌細胞轉(zhuǎn)移。見圖4。

2.6 NDRG2對Hep-2細胞侵襲能力的影響Tran-swell 實驗結(jié)果顯示，感染NDRG2 過表達慢病毒組侵襲細胞數(shù)目明顯低于感染對照病毒組（Lv-control（71.782±18.675）個，Lv-NDRG2（25.931±9.729）個，t=3.757，P=0.031），提示NDRG2 可抑制喉鱗狀細胞癌細胞侵襲。見圖5。

3 討論

喉癌是頭頸部的惡性腫瘤，近年來發(fā)病率不斷升高，每年約增加25%，且生存預(yù)后差，嚴重危害人們的生活質(zhì)量，喉鱗狀細胞癌占喉癌發(fā)病人群的95%。關(guān)于喉鱗狀細胞癌的發(fā)生機制方面的研究為臨床的基因治療提供了依據(jù)。NDRG2 是N-myc 的下游基因，又被稱為分化相關(guān)基因，在組織中的表達水平隨著發(fā)育、生長的過程不斷的發(fā)生變化，NDRG2 基因?qū)M織的生長、分化發(fā)揮著重要的作用。自NDRG2 發(fā)現(xiàn)以來，眾多研究均證實NDRG2在包括喉鱗狀細胞癌在內(nèi)的多種腫瘤組織中表達下調(diào)，是公認的抑癌分子［9-10］。

國內(nèi)研究報道NDRG1和NDRG2在喉鱗狀細胞癌細胞癌組織中低表達，研究結(jié)果顯示NDRG2 在45例喉鱗狀細胞癌中的陽性率為33.3%，在18例癌旁組織中的陽性率為83.3%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義［11］。與國內(nèi)外既往研究結(jié)果一致，本研究表明，喉鱗狀細胞癌組織中NDRG2 陽性表達率（24.39%）明顯低于癌旁組織（85.37%）。與既往研究不同的是，本研究所用癌旁組織均為配對癌旁組織，減少了免疫組化染色中因病人組織來源差異帶來的誤差。研究結(jié)果顯示：TNM III&IV 期喉鱗狀細胞癌的NDRG2陽性率顯著低于TNM I&II 期病人，說明NDRG2 可能參與喉鱗狀細胞癌的發(fā)生、發(fā)展。對伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移喉鱗狀細胞癌病人中NDRG2 陽性率低于未發(fā)生轉(zhuǎn)移病人，其他臨床病理特征分組間NDRG2陽性率差異無統(tǒng)計意義，提示NDRG2可能參與抑制喉鱗狀細胞癌淋巴轉(zhuǎn)移。

在喉鱗狀細胞癌的細胞學(xué)基礎(chǔ)研究方面，本研究應(yīng)用慢病毒過表達Hep-2細胞中NDRG2的表達，研究結(jié)果顯示Hep-2 細胞NDRG2 基因及蛋白水平明顯增高。細胞生物學(xué)特性的檢測中，Transwell 遷移及侵襲實驗結(jié)果顯示：與普通Hep-2細胞相比，過表達NDRG2 的Hep-2 細胞侵襲及轉(zhuǎn)移能力明顯降低，證實了NDRG2 可能參與了喉癌的進展和轉(zhuǎn)移，在臨床上，NDRG2的表達水平的變化影響著喉鱗狀細胞癌TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，進而影響疾病的治療效果與預(yù)后，與既往國內(nèi)外此方面的研究結(jié)果及結(jié)論一致［11］。本研究通過喉鱗狀細胞癌組織學(xué)水平及Hep-2 細胞學(xué)水平的研究相結(jié)合，實驗結(jié)果達到了預(yù)期一致的結(jié)果，更有力的證實了NDRG2作為抑癌分子參與喉鱗狀細胞癌發(fā)生及進展的過程。

在NDRG2與喉鱗狀細胞癌發(fā)生、發(fā)展的機制研究中，NDRG2可調(diào)控腫多種瘤侵襲及轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白及細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，其中部分蛋白與通路已被證實對喉鱗狀細胞癌侵襲及轉(zhuǎn)移的發(fā)揮明確的調(diào)控因素。例如，上皮性鈣黏附蛋白（E-cadherin）是鈣粘附蛋白（cadherin）家族成員，可發(fā)揮一致腫瘤細胞侵襲及轉(zhuǎn)移的作用，是已經(jīng)取得共識的腫瘤抑制分子。相關(guān)的細胞及組織學(xué)實驗顯示，與早期喉鱗狀細胞癌病人相比，E-cadherin 在中晚期喉鱗狀細胞癌中表達下調(diào)，并與不良預(yù)后及生存期密切相關(guān)［12］。而多項研究已證實 NDRG2 與 E-cadherin 表達呈正相關(guān)。其可能的機制為NDRG2 可增強糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）的活性，從而導(dǎo)致Snail 溶酶體降解，進而導(dǎo)致 E-cadherin 轉(zhuǎn)錄抑制［13-14］。因此，在喉鱗狀細胞癌中，NDRG2 也可通過此種機制上調(diào)E-cadherin的表達，從而抑制腫瘤侵襲及轉(zhuǎn)移。NDRG2 與基質(zhì)金屬蛋白酶家族（MMP）的相關(guān)性也在近年來的研究中逐漸得到證實。MMP 家族蛋白是另一類與腫瘤侵襲及轉(zhuǎn)移關(guān)系密切的促癌因素。MMP2和MMP9已被證實在喉鱗狀細胞癌中表達上調(diào)，并在腫瘤的形成、進展及預(yù)后中扮演重要角色［15，16］，而 NDRG2 在多種腫瘤中可通過調(diào)控MMP2和 MMP9 的表達而抑制腫瘤侵襲及轉(zhuǎn)移［10，17］。因此，通過抑制MMP2 和MMP9 的表達而發(fā)揮抑癌分子的作用，也可能是NDRG2抑制喉鱗狀細胞癌侵襲及轉(zhuǎn)移的分子機制之一。但是，NDRG2在喉鱗狀細胞癌抑制侵襲及轉(zhuǎn)移的具體機制，仍需進一步的實驗來逐步闡明。

綜上所述，本研究通過免疫組化從組織學(xué)方面證實發(fā)現(xiàn)NDRG2在喉鱗狀細胞癌中表達下調(diào)，通過包裝NDRG2 慢病毒提高喉鱗狀細胞癌NDRG2 的mRNA 及蛋白表達水平，進而行細胞侵襲實驗和遷移實驗證實NDRG2 可抑制喉鱗狀細胞癌Hep-2 細胞侵襲及轉(zhuǎn)移，通過體內(nèi)及體外實驗相結(jié)合說明NDRG2可能在喉鱗狀細胞癌的發(fā)生、發(fā)展中可能發(fā)揮重要的作用。在喉鱗狀細胞癌的臨床綜合治療中，以本NDRG2作為喉鱗狀細胞癌靶向治療的潛在的分子靶點，可能會發(fā)揮重要的治療作用，具有較高的臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用價值。

（本文圖1，4，5見插圖10-1）