張建明

(酒泉職業(yè)技術(shù)學(xué)院，酒泉，735000)

生活水平提高使得消費(fèi)者對(duì)裘皮的需求量逐漸增大，狐貍皮毛因其絨毛細(xì)柔、保暖性好而備受消費(fèi)者青睞，且狐貍?cè)怙L(fēng)味獨(dú)特，藥用與食用價(jià)值高，使得我國(guó)狐貍養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展較為迅速，同時(shí)相關(guān)產(chǎn)業(yè)給養(yǎng)殖戶帶來了豐厚的利潤(rùn)。由于部分養(yǎng)殖戶對(duì)狐貍生活習(xí)性不熟悉，且飼養(yǎng)環(huán)境較差，導(dǎo)致狐貍在養(yǎng)殖過程中容易感染寄生蟲病，寄生蟲病為消耗性疾病，可影響狐貍的肉質(zhì)和毛皮質(zhì)量，繼而造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1]。狐貍腸道寄生蟲病較為常見，王安等[2]對(duì)在呼倫貝爾草原野生狐貍腸道內(nèi)分離到犬復(fù)殖孔絳蟲(Dipylidiumcaninum)、多頭帶絳蟲(Taeniamulticeps)、犬鉤口線蟲(Ancylostomaduodenale)、獅弓蛔蟲(Toxascarisleonina)等多達(dá)12種腸道蠕蟲。犬腸道蛔蟲可分為犬弓首蛔蟲(Toxascariscanis)和獅弓蛔蟲，其終末宿主均為犬、貓和狐貍等動(dòng)物，其中獅弓蛔蟲生活史較為簡(jiǎn)單，犬?dāng)z入感染性卵囊后，幼蟲可在犬腸道發(fā)育為成蟲，導(dǎo)致宿主消瘦、消化不良、毛皮質(zhì)量下降等，嚴(yán)重導(dǎo)致死亡，同時(shí)對(duì)公共健康造成巨大威脅[3-4]。對(duì)于獅弓蛔蟲相關(guān)報(bào)道主要見于犬、貓等常見犬科(Canidae)動(dòng)物，但對(duì)狐貍源獅弓蛔蟲的報(bào)道較少。本研究從酒泉市某北極狐(Alopexlagopus)養(yǎng)殖場(chǎng)狐貍腸道內(nèi)分離到6條蛔蟲，通過對(duì)蟲卵及成蟲的形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)蟲株進(jìn)行鑒定，最終確定為獅弓蛔蟲病感染，本次研究為狐貍獅弓蛔蟲病的防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品來源與主要試劑

6個(gè)蛔蟲分離株分離于酒泉市某北極狐養(yǎng)殖場(chǎng)自然死亡的狐貍小腸內(nèi)(3只)，根據(jù)蛔蟲分離株的形態(tài)特征可初步鑒定為蛔蟲，將其分別命名為JQ01—JQ06。將蟲株分別保存于70%酒精中，用于形態(tài)學(xué)和分子鑒定。DNA提取試劑盒 Promega公司；蛋白酶K購(gòu)于Merck公司；PCR相關(guān)試劑購(gòu)于北京天根生化科技有限公司；引物由上海生物工程技術(shù)有限公司合成。

1.2 形態(tài)學(xué)鑒定

形態(tài)學(xué)鑒定步驟參考文獻(xiàn)[5]，將標(biāo)本放置于光學(xué)顯微鏡進(jìn)行觀察，參考相關(guān)文獻(xiàn)[6]根據(jù)頭部和尾部對(duì)蟲種進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定；采用飽和鹽水漂浮法對(duì)糞便樣品進(jìn)行處理，顯微鏡下觀察蟲卵形態(tài)，根據(jù)蟲卵形態(tài)學(xué)特征進(jìn)行初步鑒定[6]。

1.3 蟲種DNA提取與cox1基因序列擴(kuò)增

參考DNA提取試劑盒對(duì)蟲體基因組進(jìn)行提取，以基因組DNA為模板，采用文獻(xiàn)[7]中引物對(duì)蟲體線粒體細(xì)胞色素I(cox1)基因部分序列進(jìn)行擴(kuò)增，其中上游引物(cox1-F)：5′-TTTTTTGGGCATCCTGAGGTTTAT-3′，下游引物(cox1-R)：5′-TAAAGAAAGAACATAATGAAATG-3′PCR體系(50 μL)：PCR easy mix 25 μL、上下游引物(10 pmol)各2 μL、DNA模板3 μL、雙蒸水18 μL，混勻后低速離心5 s，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照，其模板分別為雙蒸水和實(shí)驗(yàn)室保存的犬獅弓蛔蟲DNA樣品；擴(kuò)增條件為：94 ℃5 min；94 ℃30 s，55 ℃30 s，72 ℃30 s，共35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)過凝膠電泳檢測(cè)，預(yù)期片段大小為420 bp左右。

1.4 cox1基因序列測(cè)序與分析

將PCR陽(yáng)性產(chǎn)物進(jìn)行純化后送至上海生物工程技術(shù)有限公司雙向測(cè)序，從GenBank中下載具有代表性蛔蟲cox1基因序列，應(yīng)用DNAstar軟件對(duì)核苷酸序列同源性進(jìn)行分析，以MEGA 5.0軟件分析序列的堿基比例，同時(shí)構(gòu)建系統(tǒng)種系發(fā)育樹。

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果

對(duì)蟲卵特征進(jìn)行觀察，該蟲卵為橢圓形，外有光滑的殼，符合獅弓蛔蟲蟲卵特征[8]，故也將從病死狐貍腸道分離蛔蟲分離株初步判定為獅弓蛔蟲(圖1)。

圖1 獅弓蛔蟲蟲卵(左圖)及成蟲分離株(右圖)形態(tài)學(xué)觀察Fig.1 Morphological observation of egg(left)and adult isolates(right)of Toxascaris leonina

2.2 cox1基因序列PCR擴(kuò)增結(jié)果

本次研究對(duì)6個(gè)狐貍源蛔蟲分離株的線粒體cox1基因部分序列進(jìn)行擴(kuò)增，凝膠電泳圖結(jié)果如圖2所示，6個(gè)樣品均擴(kuò)增出約420 bp的條帶，與預(yù)期大小基本一致，陰性對(duì)照無(wú)條帶。

2.3 蛔蟲cox1基因序列分析

測(cè)序結(jié)果顯示，本次研究獲得的6個(gè)蛔蟲cox1基因序列大小一致，為418 bp，其A、T、C、G堿基所占平均比例分別為17.82%、44.50%、11.14%和26.49%，序列表現(xiàn)出明顯的AT堿基富集(62.38%)。6個(gè)蟲株的cox1基因序列同源性為99.4%—100.0%，與已知獅弓蛔蟲分離株(KC293944.1、KC293932.1)同源性為99.4%—99.7%，與犬弓首蛔蟲(KC2939 03.1、KC293913.1)、貍貓弓蛔蟲(Toxocaratanuki)(AB446546.1)、豬蛔蟲(Ascarissuum)(AB591805.1)和人蛔蟲(Ascarislumbricoides)(AB591798.1)相應(yīng)基因序列同源性為86.2%—91.9%。序列同源性分析結(jié)果表明6個(gè)狐貍源蛔蟲分離株與獅弓蛔蟲同源性最高(圖3)，將其基因序列提交至GenBank收錄，其序列號(hào)為(MK591006.1-MK591011.1)。

圖2 狐貍源蛔蟲線粒體cox1基因序列擴(kuò)增凝膠電泳圖Fig.2 Analysis of amplification of mitochondrial cox1 gene sequences from foxy roundworm 注：M：DL2000 marker；P：陽(yáng)性對(duì)照；N：陰性對(duì)照；1—6：檢測(cè)樣品 Note：M，DL2000 marker.P，positive sample.N，negative sample.1-6，six tested specimens

圖3 狐貍源蛔蟲與其他蛔蟲cox1基因序列同源性比較結(jié)果Fig.3 Analysis of homology comparison of cox1 gene sequences of Ascaris from foxes and other animals

2.4 cox1基因序列系統(tǒng)進(jìn)化分析

為了進(jìn)一步分析本研究獲得的6株狐貍源蛔蟲分離株與其他已知蛔蟲的種系發(fā)育關(guān)系，以貍貓弓蛔蟲(AB446546.1)為外群，應(yīng)用MEGA 5.0軟件中NJ法構(gòu)建系統(tǒng)種系發(fā)育樹。結(jié)果如圖4所示，6個(gè)蛔蟲分離株與已知不同宿主源獅弓蛔蟲(KC293944.1、AJ920064.1、MH795159.1和KC293932.1)所屬分支聚為同一支，與豬蛔蟲(AB591805.1)和人蛔蟲(AB591798.1)相距較近，與犬弓首蛔蟲所屬分支相距較遠(yuǎn)。結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果，可將本次研究獲得的6個(gè)狐貍源蛔蟲鑒定為獅弓蛔蟲。

圖4 基于cox1基因序列構(gòu)建狐貍源蛔蟲與其他蛔蟲的種系發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree based on the cox1 gene sequences of Ascaris from foxes and other animals

3 討論

蛔蟲病是常見的寄生蟲病，主要寄生于宿主小腸內(nèi)，導(dǎo)致宿主生長(zhǎng)緩慢、免疫力下降、腸道堵塞等，常繼發(fā)其他感染性疾病，甚至導(dǎo)致宿主死亡[9-10]。獅弓蛔蟲屬于蛔目(Ascaridida)，蛔科(Ascarididae)，弓蛔屬，可感染犬科、貓科(Felidae)等多種哺乳動(dòng)物，掠奪宿主營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，引發(fā)胃腸炎、腸道堵塞等臨床癥狀，同時(shí)感染獅弓蛔蟲的宿主可隨糞便排出感染性蟲卵，感染性蟲卵污染水源、飼料或土壤后，其他宿主接觸或吞食含感染性蟲卵的土壤或食物可感染該病。

由于寄生蟲形態(tài)學(xué)特征(特別是形態(tài)學(xué)相近的蟲種)易受地理環(huán)境的影響，對(duì)寄生蟲進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定有一定的局限性[11]，以PCR技術(shù)為代表的分子生物學(xué)技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于寄生蟲的蟲種鑒定，其中線粒體cox1基因廣泛用于寄生蟲的分子鑒定和種系遺傳學(xué)研究[12-14]。目前，關(guān)于狐貍源蛔蟲的分子鑒定與遺傳變異研究較少。在形態(tài)學(xué)鑒定的基礎(chǔ)上，本次研究通過對(duì)狐貍源蛔蟲cox1基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增與分析，結(jié)果確定本次研究分離的6株狐貍源蛔蟲均為獅弓蛔蟲，其結(jié)果印證前期研究[2]，序列分析結(jié)果顯示，狐貍源獅弓蛔蟲cox1基因序列較為保守，種內(nèi)遺傳差異為0—0.6%，低于獵豹(Acinonyxjubatus)獅弓蛔蟲cox1基因序列種內(nèi)差異(1.4%—6.8%)[14]，提示在進(jìn)化過程中，不同種屬獅弓蛔蟲cox1基因序列變異情況有所差異，同時(shí)狐貍源獅弓蛔蟲cox1序列與其他蛔蟲同源性為8.1%—13.8%，種內(nèi)遺傳差異遠(yuǎn)低于種間變異，提示cox1序列可作為狐貍源獅弓蛔蟲分子鑒定標(biāo)記，同時(shí)提示該養(yǎng)殖場(chǎng)需加強(qiáng)對(duì)狐貍的飼養(yǎng)管理水平，定期做好驅(qū)蟲工作。