陳全助，葉小真，吳 松，江仲鵬，鄭婉錚，龔 輝，宋 漳

(1.福建農(nóng)林大學(xué)金山學(xué)院，福建 福州 350002； 2.福建農(nóng)林大學(xué)林學(xué)院，福建 福州 350002；3.南平市建陽(yáng)區(qū)林業(yè)局，福建 南平 354200)

閩楠(Phoebebournei)為樟科(Lauraceae)楠屬(Phoebe)喬木，主要分布于亞熱帶常綠闊葉林，其木材結(jié)構(gòu)細(xì)膩、紋理美觀、芳香耐腐，是我國(guó)特有珍稀用材樹種、國(guó)家二級(jí)保護(hù)瀕危植物，也是福建省珍貴優(yōu)良鄉(xiāng)土用材樹種[1-4]，在國(guó)家木材戰(zhàn)略儲(chǔ)備中占有重要地位。閩楠干形通直優(yōu)美，枝葉雅致清秀，生態(tài)功能顯著，是重要的庭院觀賞和城市綠化樹種[1，5]。閩楠葉斑病(Pestalotiopsismicrospora)是近年來楠木大面積推廣種植過程中苗木培育基地和幼齡林分新發(fā)現(xiàn)的葉部病害，造成葉面斑枯，影響植株正常生長(zhǎng)[2]，同時(shí)帶病苗木也成了病害擴(kuò)散的傳染源。當(dāng)前有關(guān)閩楠葉斑病防治的研究鮮有報(bào)道，本研究擬通過高效低毒殺菌劑、植物浸提物對(duì)閩楠葉斑病菌進(jìn)行室內(nèi)毒力測(cè)定篩選，旨在為閩楠葉斑病害防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

2019年，帶有葉斑病病原小孢擬盤多毛孢ZZ-03菌株的閩楠病組織樣品采自漳州南靖，帶回福建農(nóng)林大學(xué)森林保護(hù)研究所實(shí)驗(yàn)室分離鑒定，作為藥劑篩選供試菌株。

1.2 供試化學(xué)殺菌劑

1.3 供試抑菌植物及其使用部位

大青(Foliumisatidis)、香樟(Cinnamomumcamphora)、銀杏(Ginkgobiloba)、艾葉(Artemisiaargyi)的供試部位為葉片；苦楝(Meliaazedarach)、黃柏(Phellodendronchinense)的供試部位為樹皮；苦參(Sophoraflavescens)、北豆根(Menispermumdauricum)、遠(yuǎn)志(Polygalatenuifolia)的供試部位為根；知母(Anemarrhenaasphodeloides)、黃連(Coptischinensis)的供試部位為根莖；連翹(Forsythiasuspensa)的供試部位為果實(shí)。

1.4 化學(xué)殺菌劑室內(nèi)毒力測(cè)定

1.4.1 病原菌絲對(duì)化學(xué)殺菌劑敏感性測(cè)定 藥物毒力測(cè)定采用含毒介質(zhì)培養(yǎng)菌絲生長(zhǎng)速率抑制法[6-7]。藥劑配制采用外比法[7-8]，制成系列濃度梯度含藥均勻的PDA培養(yǎng)基平板，以不含藥PDA培養(yǎng)基作對(duì)照。各殺菌劑帶藥質(zhì)量濃度：世高、百菌清、異菌·氟啶胺、大生、克菌丹為20.00、10.00、6.70、5.00、3.30 μg·mL-1，多·錳鋅為2.00、1.30、1.00、0.80、0.67 μg·mL-1，曹氏甲托為0.20、0.13、0.10、0.08、0.067 μg·mL-1，惡霉靈為50.00、33.00、25.00、20.00、17.00 μg·mL-1。取直徑5 mm供試菌株菌餅，接種各處理PDA培養(yǎng)基，每處理各重復(fù)5次，置(28±1) ℃恒溫培養(yǎng)5 d后，采用“十字交叉法”測(cè)定菌落直徑，計(jì)算相對(duì)抑制率[8-9]。

1.4.2 孢子萌發(fā)對(duì)化學(xué)殺菌劑敏感性測(cè)定 敏感性測(cè)定采用分生孢子萌發(fā)抑制法[10]。病原分生孢子配制成帶藥質(zhì)量濃度分別為20.00、10.00、6.70、5.00、3.30 μg·mL-1、孢子質(zhì)量為2.5×105孢子·mL-1的懸浮液后，吸取30 μL滴加于帶同樣藥劑濃度的PDA培養(yǎng)基載玻片，涂抹均勻，以不含藥劑作對(duì)照，3次重復(fù)，置培養(yǎng)皿內(nèi)保濕，(28±1) ℃恒溫培養(yǎng)6 h，待孢子萌發(fā)后隨機(jī)抽取5個(gè)視野約100個(gè)分生孢子，統(tǒng)計(jì)孢子萌發(fā)率，計(jì)算抑制率。

1.5 植物源浸提物抑菌效果測(cè)定

稱取烘干、粉碎、過40目篩的供試植物粉末30 g，置500 mL錐形瓶中，加75%乙醇溶液200 mL，80 ℃水浴鍋恒溫浸提6 h后真空抽濾，濾渣用等量75%乙醇溶液繼續(xù)浸提6 h后再次過濾，合并濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至膏狀，4 ℃保存?zhèn)溆?。植物提取物菌絲抑菌試驗(yàn)方法同1.4.1，取直徑5 mm菌餅接種由浸提物和PDA培養(yǎng)基配制而成的質(zhì)量濃度為0.1 mg·mL-1的帶藥培養(yǎng)基，(28±1) ℃恒溫培養(yǎng)5 d后采用“十字交叉法”測(cè)定菌落直徑，統(tǒng)計(jì)各浸提物對(duì)菌絲生長(zhǎng)的抑制率，以不含浸提物作對(duì)照，每處理各重復(fù)5次。分生孢子萌發(fā)對(duì)浸提物敏感性測(cè)定方法同1.4.2，吸取含藥質(zhì)量濃度0.1 mg·mL-1、孢子濃度2.5×105孢子·mL-1懸浮液30 μL，均勻涂抹含同樣浸提物濃度的PDA培養(yǎng)基載玻片，(28±1) ℃恒溫培養(yǎng)5 h，孢子萌發(fā)后隨機(jī)抽取5個(gè)視野約100個(gè)分生孢子，統(tǒng)計(jì)孢子萌發(fā)率，計(jì)算抑制率。

1.6 數(shù)據(jù)分析

參照于靜亞等[9]的方法，采用IBM SPSS Statistics 21軟件對(duì)測(cè)定數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。以各處理藥劑濃度對(duì)數(shù)值為自變量(x)，相應(yīng)處理對(duì)病原菌絲和分生孢子抑制機(jī)率值為因變量(y)，擬合毒力回歸方程。根據(jù)方程得出各殺菌劑的抑菌中濃度EC50，EC50值越小表明藥劑毒力作用越大，故以EC50比較不同藥劑對(duì)該病原毒力作用的強(qiáng)弱。

2 結(jié)果與分析

2.1 化學(xué)殺菌劑對(duì)病原菌絲生長(zhǎng)的影響

由表1、圖1可知，供試的8種化學(xué)殺菌劑對(duì)閩楠葉斑病病原小孢擬盤多毛孢ZZ-03菌株菌絲生長(zhǎng)均具有抑制效果，但不同藥劑之間的EC50值相差各異，藥劑間的抑制效果存在差異。從毒力回歸方程和EC50值的大小可以看出，供試藥劑中對(duì)菌絲生長(zhǎng)抑制效果最好的是曹氏甲托、多·錳鋅，EC50值分別是0.115、0.718μg·mL-1，均小于1 μg·mL-1；其次是百菌清、世高、異菌·氟啶胺，EC50值分別是3.160、3.717、4.420 μg·mL-1，介于1～5 μg·mL-1之間；再次是大生，EC50值為9.609 μg·mL-1；抑菌效果較差的是惡霉靈、克菌丹，EC50值分別是25.400、29.813 μg·mL-1。

表1 供試殺菌劑對(duì)小孢擬盤多毛孢ZZ-03菌株菌絲生長(zhǎng)的抑制效果

A為曹氏甲托；B為多·錳鋅；C為百菌清；D為世高；E為異菌·氟啶胺圖1 不同化學(xué)殺菌劑對(duì)小孢擬盤多毛孢ZZ-03菌株菌絲生長(zhǎng)的抑制效果

2.2 化學(xué)殺菌劑對(duì)病原分生孢子萌發(fā)的影響

由表2可知，8種殺菌劑對(duì)病原菌小孢擬盤多毛孢ZZ-03菌株分生孢子萌發(fā)抑制效果差異不一，不同藥劑間EC50值差異性相對(duì)較大。供試藥劑中，抑制效果最好的是異菌·氟啶胺、曹氏甲托、多·錳鋅，EC50值分別為2.291、3.419、4.809 μg·mL-1，介于1～5 μg·mL-1之間；其次是百菌清，EC50值為8.113 μg·mL-1；再次是克菌丹、惡霉靈、世高，EC50值分別為15.852、17.005、18.849 μg·mL-1，介于15～20 μg·mL-1之間；抑制效果最差的是大生，EC50值48.063 μg·mL-1。

表2 供試殺菌劑對(duì)小孢擬盤多毛孢ZZ-03菌株分生孢子萌發(fā)的抑制效果

2.3 植物提取物對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響

不同大寫字母為差異極顯著(P<0.01)，下同。 圖2 12種植物提取物對(duì)小孢擬盤多毛孢ZZ-03菌株菌絲生長(zhǎng)的抑制率

由圖2、圖3可知，供試的12種植物浸提物對(duì)閩楠葉斑病原小孢擬盤多毛孢ZZ-03菌株菌絲生長(zhǎng)的影響各異，除銀杏、香樟、大青浸提物對(duì)病原菌絲生長(zhǎng)有促進(jìn)作用外，其它植物浸提物對(duì)病原菌絲生長(zhǎng)則均有抑制作用，各植物浸提物對(duì)病原菌株菌絲生長(zhǎng)的影響差異極顯著(P<0.01)。具有抑制效果的植物浸提物中，以知母浸提物抑制效果最顯著，平均抑制率高達(dá)92.52%；其次是遠(yuǎn)志、黃連，抑制率分別為75.93%、70.14%；再次是黃柏，抑制率為57.59%；其它植物浸提物的抑制率則相對(duì)較低。

圖3 植物提取物對(duì)小孢擬盤多毛孢ZZ-03菌株菌絲生長(zhǎng)的抑制效果

2.4 植物提取物對(duì)病原分生孢子萌發(fā)的影響

由圖4可知，供試植物浸提物對(duì)閩楠葉斑病原小孢擬盤多毛孢ZZ-03菌株分生孢子萌發(fā)的影響各異，除香樟、苦楝、銀杏和北豆根4種浸提物沒有抑制效果外，其它植物浸提物對(duì)分生孢子萌發(fā)均具有明顯抑制效果。其中以黃連、連翹浸提物抑制率極顯著高于其它植物浸提物(P<0.01)；其次是苦參浸提物，黃連、連翹、苦參3種植物浸提物的抑制率均超過50%；再次是黃柏，抑制率為43.67%；抑制效果較差的是大青、知母、艾葉、遠(yuǎn)志等植物浸提物，抑制率介于10%～30%。

圖4 植物提取物對(duì)小孢擬盤多毛孢ZZ-03菌株分生孢子萌發(fā)的抑制效果

3 結(jié)論與討論

小孢擬盤多毛孢系擬盤多毛孢屬(Pestalotiopsis)真菌，是閩楠葉斑病[2]、石楠(Photiniaserrulata)葉斑病[9]、澳洲堅(jiān)果(Macadamiaspp.)葉枯病[11]、油茶(Camelliaoleifera)葉枯病[12]、美國(guó)紅楓(Acerrubrum)褐斑病[13]的致病菌。關(guān)于小孢擬盤多毛孢病菌防治藥劑篩選，于靜亞等[9]認(rèn)為咪鮮胺、甲基托布津和苯醚甲環(huán)唑?qū)κ~斑病菌的抑制效果較佳；蔣桂芝等[11]認(rèn)為多菌靈、戊唑醇和烯唑醇等藥劑對(duì)澳洲堅(jiān)果葉枯病菌菌絲生長(zhǎng)抑制效果最好；陽(yáng)廷密等[14]認(rèn)為咪鮮胺、代森錳鋅、苯醚甲環(huán)唑、吡唑醚菌酯等藥劑能夠有效抑制柑橘黃斑落葉病菌菌絲生長(zhǎng)，而咪鮮胺、嘧菌酯、苯醚甲環(huán)唑、乙蒜素和吡唑醚菌等藥劑均能有效抑制其孢子萌發(fā)。本研究通過菌絲生長(zhǎng)抑制法和分生孢子萌發(fā)抑制法分別測(cè)定了世高、百菌清、異菌·氟啶胺、大生、克菌丹、多·錳鋅、曹氏甲托和惡霉靈等8種藥劑對(duì)閩楠葉斑病菌小孢擬盤多毛孢ZZ-03菌株的抑制作用，結(jié)果表明，供試殺菌劑中，以曹氏甲托、多·錳鋅對(duì)菌絲生長(zhǎng)的抑制效果最好，異菌·氟啶胺、曹氏甲托、多·錳鋅對(duì)分生孢子萌發(fā)的抑制效果較好，其中曹氏甲托和多·錳鋅2種殺菌劑表現(xiàn)出同時(shí)對(duì)病原菌絲和分生孢子具有較好的抑制效果，但異菌·氟啶胺對(duì)分生孢子的抑制效果較曹氏甲托和多·錳鋅強(qiáng)，后續(xù)將對(duì)室內(nèi)篩選的藥劑進(jìn)行田間防治試驗(yàn)，以便田間推廣使用。此外，當(dāng)前閩楠枝枯病等病害在福建省普遍嚴(yán)重發(fā)生，在開展葉斑病野外防治試驗(yàn)的同時(shí)可兼顧調(diào)查分析所篩藥劑對(duì)這些病害的抑制效果。曹氏甲托對(duì)閩楠葉斑病菌小孢擬盤多毛孢ZZ-03菌株菌絲的抑制效果與于靜亞等[9]測(cè)定的結(jié)果一致，表明曹氏甲托對(duì)小孢擬盤多毛孢具有良好的抑制效果。與單型劑大生(80%代森錳鋅)相比，多·錳鋅表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑菌效果可能與該藥劑為多菌靈和代森錳鋅混配劑型有關(guān)，抑制效果的增強(qiáng)是否與多菌靈有關(guān)有待進(jìn)一步深入研究分析。

盡管化學(xué)殺菌劑在植物病害防治過程中成效顯著，但化學(xué)殺菌劑易污染環(huán)境，病原容易產(chǎn)生抗藥性和耐藥性等問題，因此探尋環(huán)境友好型、不易產(chǎn)生抗、耐藥性植物源農(nóng)藥將成為今后植物病害防治的發(fā)展趨勢(shì)。植物浸提物因具有高效、低毒和低殘留等優(yōu)點(diǎn)，成為時(shí)下新型無公害殺菌劑研究開發(fā)的熱點(diǎn)[15-16]。本試驗(yàn)以知母、遠(yuǎn)志、黃連、黃柏和連翹等12種植物提取物對(duì)閩楠葉斑病菌小孢擬盤多毛孢ZZ-03菌株進(jìn)行抑菌活性室內(nèi)篩選，結(jié)果發(fā)現(xiàn)知母浸提物對(duì)病原菌絲生長(zhǎng)的抑制效果顯著，而黃連和連翹浸提物則能有效抑制病原分生孢子萌發(fā)。知母、黃連和連翹是傳統(tǒng)中藥材，具有潛在抑菌活性，是天然的生物源抑菌劑。前人研究結(jié)果表明，知母對(duì)馬鈴薯晚疫病菌[17]、黃連對(duì)松材線蟲[18]，以及連翹對(duì)芒果大莖點(diǎn)霉(Macrophomamangiferae)和擬莖點(diǎn)霉(Phomposismangiferae)[19]表現(xiàn)出抑制作用。鑒于此，知母、黃連和連翹可作為抑制閩楠葉斑病菌小孢擬盤多毛孢ZZ-03菌株植物源生物農(nóng)藥，具有潛在開發(fā)應(yīng)用研究?jī)r(jià)值，后續(xù)工作有待對(duì)該植物源抑菌劑的抑菌活性物質(zhì)及其結(jié)構(gòu)和抑菌機(jī)理進(jìn)行進(jìn)一步深入研究。