葉小榮,王理富,麗水市人民醫(yī)院創(chuàng)傷急腹癥、疝與腹壁外科 浙江省麗水市 323000

潘德標(biāo),麗水市人民醫(yī)院肝膽外科 浙江省麗水市 323000

0 引言

肝癌是全球第六大常見的惡性腫瘤,且其死亡率在所有惡性腫瘤中排名前三[1].據(jù)流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)[2],肝癌患者主要分布在亞洲和非洲;尤其是在我國(guó),由于丙型肝炎和乙型肝炎患者眾多,造成肝癌發(fā)病率一直居高不下.此外,脂肪肝也具有進(jìn)展為原發(fā)性肝癌的風(fēng)險(xiǎn)[3].證據(jù)[4]表明,肝癌的關(guān)鍵調(diào)控基因的改變與肝癌的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后相關(guān).因此,迫切需要對(duì)肝癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵基因進(jìn)行研究.

微小RNA (microRNAs,miRNAs)是指一類大約22個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼小RNA,它們可與靶基因以堿基互補(bǔ)配對(duì)模式一一結(jié)合,并在轉(zhuǎn)錄后水平參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、凋亡等多種生物學(xué)功能[5].研究[5]表明,許多miRNAs在腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展中發(fā)揮著促癌或抑癌的作用.其中,miR-145-3p在頭頸癌、肺癌和胃癌等腫瘤中表達(dá)下調(diào),且其可發(fā)揮抑癌的作用[6-8].而miR-145-3p在肝癌中的表達(dá)和作用并不清楚,因此,本研究旨在調(diào)查miR-145-3p在肝癌進(jìn)展中的作用,以及其對(duì)肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)的調(diào)控作用.

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 一般材料:胎牛血清和MEM培養(yǎng)基購(gòu)于美國(guó)Gbico公司;miScipt II RT試劑盒、miScript SYBR Green PCR試劑盒、miR-145-3p引物和U6引物均購(gòu)于美國(guó)Qiagen公司;Trizol和Lipofectamine 2000試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司;miR-145-3p抑制劑(miR-145-3p inhibitor)、miR-145-3p模擬物(miR-145-3p mimic)、miR陰性對(duì)照(miR negative control,miR-NC)、pcDNA3.1-4型黏蛋白(mucin4,MUC4)和pcDNA3.1-空載體(pcDNA3.1-vector)購(gòu)自廣州銳博生物科技有限公司;CCK-8細(xì)胞增殖計(jì)數(shù)試劑盒、TUNEL熒光(綠色)檢測(cè)試劑盒、雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒和細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物科技有限公司;MUC4和GAPDH抗體以及二抗購(gòu)自武漢菲恩生物科技有限公司.

1.1.2 組織樣本收集:本研究收集的臨床樣本來(lái)自于2017-09/2018-09間在我院行腫瘤切除術(shù)的25例肝癌患者(男女比例:男20例、女5例;年齡:38-63歲,平均年齡51.5歲±4.3歲;T分期:T1期5例、T2期7例、T3期8例、T4期5例;病理分型:肝細(xì)胞型22例、膽管細(xì)胞型2例、混合細(xì)胞型:1例),收集肝癌和癌旁組織樣本.本實(shí)驗(yàn)獲得了所有受試者的知情同意書以及醫(yī)院倫理委員會(huì)的同意和批準(zhǔn).

1.1.3 細(xì)胞培養(yǎng):人肝癌細(xì)胞株Hep3B和人正常肝細(xì)胞株L-02購(gòu)自于武漢普諾賽生命科技有限公司,肝癌細(xì)胞株Huh7、SMMC-7721和HepG2為本實(shí)驗(yàn)室留存.所有細(xì)胞在含有10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)基培養(yǎng).

1.2 方法

1.2.1 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染:按照說(shuō)明書步驟,使用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑分別將miR-145-3p mimic、miR-145-3p inhibitor或miR-NC分別轉(zhuǎn)入Hep3B細(xì)胞中,轉(zhuǎn)染劑量為20 nnmol/L.轉(zhuǎn)染48 h后,通過(guò)RT-qPCR鑒定轉(zhuǎn)染效率.

1.2.2 CCK-8分析:取已轉(zhuǎn)染miR-145-3p mimic、miR-145-3p inhibitor或miR-NC的Hep3B細(xì)胞,種植于96孔板(1×104個(gè)/孔),分別培養(yǎng)1-4 d后,按照CCK-8細(xì)胞增殖計(jì)數(shù)試劑盒說(shuō)明書步驟,用酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm波長(zhǎng)處吸光度值,并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算細(xì)胞數(shù).

1.2.3 細(xì)胞周期分析:取已轉(zhuǎn)染miR-145-3p mimic、miR-145-3p inhibitor或miR-NC的Hep3B細(xì)胞,用70%乙醇溶液在4℃下固定過(guò)夜,用PBS洗滌細(xì)胞2次后,用RNase A (100 μg/mL)和PI (50 μg/mL)孵育細(xì)胞30 min.用FACS Canto流式細(xì)胞儀(BD Biosciences)測(cè)定DNA含量,并通過(guò)FACS Diva Software(BD Biosciences)來(lái)評(píng)估細(xì)胞周期譜.

1.2.4 TUNEL分析:取已轉(zhuǎn)染miR-145-3p mimic、miR-145-3p inhibitor或miR-NC的Hep3B細(xì)胞,繼續(xù)培養(yǎng)48 h后,按照TUNEL熒光檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書步驟,用攜帶熒光素的dUTP (綠色)和DAPI (綠色)對(duì)其進(jìn)行避光染色.通過(guò)熒光顯微鏡觀察細(xì)胞凋亡情況.

1.2.5 Western blot分析:取已轉(zhuǎn)染miR-145-3p mimic、miR-145-3p inhibitor或miR-NC的Hep3B細(xì)胞,繼續(xù)培養(yǎng)48 h后,用RIPA提取蛋白,并通過(guò)常規(guī)Western blot法檢測(cè)細(xì)胞MUC4蛋白的表達(dá),其中MUC4的稀釋濃度為1:1000,并以GAPDH為內(nèi)參,通過(guò)Image J軟件量化MUC4的相對(duì)表達(dá)量.

1.2.6 RT-qPCR分析:按照說(shuō)明書步驟,用Trizol試劑從組織或細(xì)胞系中提取的RNA,并通過(guò)miScipt II RT 試劑盒對(duì)提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,然后以cDNA為模板混合miR-145-3p引物和U6引物,使用miScript SYBR Green PCR試劑盒通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR儀進(jìn)行RT-qPCR反應(yīng),反應(yīng)程序設(shè)置為95℃預(yù)變性5 min,然后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)(95℃ 5 s,60℃ 30 s).引物序列:miR-145-3p (正向引物:5’-GCGTCCAGTTTTCCCAGGA-3’,反向引物:5’-TGGTGTCGTGGAGTCG-3’);U6(正向引物:5’-CTCGCTTCGGCAGCACATATACT-3’,反向引物:5’-ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC-3’);MUC4 (正向引物:5’-GCCCAAGCTACAGTGTGACTCA-3,反向引物:5’-ATGGTGCCGTTGTAATTTGTTGT-3’);GAPDH(正向引物:5’-GGTGGTCTCCTCTGACTTCAACA-3’,反向引物:5’-GTTGCTGTAGCCAAATTCGTTGT-3’).并以U6作為miR-145-3p的內(nèi)參,以GAPDH作為MUC4的內(nèi)參,用2-△△CT法計(jì)算目的基因的表達(dá)水平.

1.2.7 雙熒光素酶報(bào)告基因分析:將含有miR-145-3p假定結(jié)合位點(diǎn)的MUC4野生型或突變型的3’非翻譯區(qū)(UTR)克隆到psiCHECK-2載體上.將構(gòu)建的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入已轉(zhuǎn)染miR-145-3p mimic、miR-145-3p inhibitor或miR-NC的Hep3B細(xì)胞中.48 h后,根據(jù)雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書使用Dual-Luciferase Reporter系統(tǒng)評(píng)估細(xì)胞裂解物中的熒光素酶活性.

1.2.8 共轉(zhuǎn)染分析:取已轉(zhuǎn)染miR-145-3p mimic的Hep3B細(xì)胞,用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑分別將20 nmol/L劑量的pcDNA-vector或pcDNA-MUC4分別轉(zhuǎn)入細(xì)胞中.轉(zhuǎn)染48 h后用Western blot鑒定轉(zhuǎn)染效率.取共轉(zhuǎn)成功的細(xì)胞,繼續(xù)培養(yǎng)48 h后,用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力,用TUNEL染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡.

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用mean±SD表示,利用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析.倆組數(shù)據(jù)比較采用t檢驗(yàn),多組數(shù)據(jù)兩兩比較,采用方差分析后Bonfferoni檢驗(yàn).P＜0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2 結(jié)果

2.1 miR-145-3p在肝癌中低表達(dá) 圖1A顯示,與癌旁組織比較,肝癌組織中miR-145-3p表達(dá)水平明顯降低(P＜0.01),且隨著T分期呈現(xiàn)遞減現(xiàn)象.與正常肝細(xì)胞系L-02比較,肝癌細(xì)胞系中miR-145-3p也呈低表達(dá)水平(P＜0.01,圖1B).這些結(jié)果表明miR-145-3p的表達(dá)水平與肝癌之間存在密切的關(guān)系.

2.2 過(guò)表達(dá)miR-145-3p抑制肝癌細(xì)胞增殖 圖2A顯示,與miR-NC組比較,miR-145-3p inhibitor組中miR-145-3p表達(dá)水平明顯降低(P＜0.01),miR-145-3p mimic組中miR-145-3p表達(dá)水平明顯增加(P＜0.01),說(shuō)明成功構(gòu)建了轉(zhuǎn)染細(xì)胞.CCK-8細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果(圖2B)顯示,與轉(zhuǎn)染miRNC的細(xì)胞比較,敲減miR-145-3p的Hep3B細(xì)胞生長(zhǎng)明顯加快(P＜0.01),過(guò)表達(dá)miR-145-3p的Hep3B細(xì)胞生長(zhǎng)明顯減緩(P＜0.05或P＜0.01);細(xì)胞周期檢測(cè)(圖2C和D)結(jié)果顯示,與轉(zhuǎn)染miR-NC的細(xì)胞比較,敲減miR-145-3p的Hep3B細(xì)胞中S期比例明顯增多(P＜0.01)和G0/G1期比例明顯減少(P＜0.01),過(guò)表達(dá)miR-145-3p的Hep3B細(xì)胞中S期比例明顯減少(P＜0.01)和G0/G1期比例明顯增多(P＜0.01).

圖1 miR-145-3p在肝癌組織和肝癌細(xì)胞中低表達(dá). A:RT-qPCR檢測(cè)不同T分期的肝癌組織與癌旁組織中miR-145-3p的表達(dá)水平,與癌旁組織比較,bP＜0.01;n=5-8;B:RT-qPCR檢測(cè)L-02細(xì)胞和不同的肝癌細(xì)胞中miR-145-3p的表達(dá)水平,與L-02細(xì)胞比較,dP＜0.01;n=3.

圖2 過(guò)表達(dá)miR-145-3p抑制Hep3B細(xì)胞增殖. A:RT-qPCR鑒定miR-145-3p inhibitor/mimic轉(zhuǎn)染效率;B:CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng);C和D:流式細(xì)胞儀法檢測(cè)細(xì)胞周期分布.與miR-NC組比較,aP＜0.05,bP＜0.01,cP＜0.001;n=3.

2.3 過(guò)表達(dá)miR-145-3p促進(jìn)肝癌細(xì)胞的凋亡 TUNEL法結(jié)果(圖3)顯示,與轉(zhuǎn)染miR-NC的細(xì)胞比較,敲減miR-145-3p的Hep3B細(xì)胞中TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞比例明顯減少(P＜0.01),過(guò)表達(dá)miR-145-3p的Hep3B細(xì)胞中TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞比例明顯增多(P＜0.01).

圖3 過(guò)表達(dá)miR-145-3p抑制肝癌細(xì)胞凋亡. A:Hep3B細(xì)胞TUNEL染色代表圖;B:TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)百分比的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù).與miR-NC組比較,bP＜0.01;n=3.

圖4 miR-145-3p直接靶向4型黏蛋白. A:Western blot檢測(cè)癌旁組織和肝癌組織中4型黏蛋白(mucin4,MUC4)的表達(dá)水平;P:癌旁組織;C:癌組織;與癌旁組織組比較,bP＜0.01;n=5;B:Western blot檢測(cè)L-02細(xì)胞和不同的肝癌細(xì)胞中MUC4的蛋白表達(dá)水平;與L-02細(xì)胞比較,dP＜0.01;n=3;C和D:轉(zhuǎn)染 miR-145-3p mimic和miR-145-3p inhibitor后,分別用Western blot和RT-qPCR檢測(cè)MUC4的蛋白(C)和mRNA(D)表達(dá)水平;E:雙熒光素酶報(bào)告基因分析熒光素酶活性.與miR-NC組比較,fP＜0.01;n=3.MUC4:4型黏蛋白.

圖5 過(guò)表達(dá)4型黏蛋白逆轉(zhuǎn)過(guò)表達(dá)miR-145-3p對(duì)細(xì)胞存活的抑制作用. A和B:Western blot檢測(cè)4型黏蛋白的表達(dá);C:CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力;D和E:代表性TUNEL染色圖和TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)百分比的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù).與miR-145-3p mimic+pCDNA-vector組比較,bP＜0.01;n=3.

2.4 MUC4是miR-145-3p的靶基因 MUC4是miR-145-3p的預(yù)測(cè)靶基因之一.Western blot結(jié)果(圖4A和B)顯示,在肝癌組織(圖4A)和肝癌細(xì)胞系(圖4B)中MUC4表達(dá)明顯增加(P＜0.01).進(jìn)一步檢測(cè)的結(jié)果(圖4C和D)顯示,與轉(zhuǎn)染miR-NC的細(xì)胞比較,過(guò)表達(dá)miR-145-3p的Hep3B細(xì)胞中MUC4蛋白和mRNA表達(dá)顯著下調(diào)(P＜0.01),敲減miR-145-3p的Hep3B細(xì)胞中MUC4蛋白和mRNA表達(dá)上調(diào)(P＜0.01).雙熒光素酶報(bào)告基因分析結(jié)果(圖4E)顯示,在轉(zhuǎn)染MUC4的野生型Hep3B細(xì)胞中,與miR-NC組比較,miR-145-3p mimic組熒光素酶活性顯著降低(P＜0.01),而miR-145-3p inhibitor組熒光素酶活性明顯增加(P＜0.01).

2.5 過(guò)表達(dá)MUC4逆轉(zhuǎn)過(guò)表達(dá)miR-145-3p對(duì)細(xì)胞存活的抑制作用 圖5A和B顯示,miR-145-3p mimic+pCDNAMUC4轉(zhuǎn)染細(xì)胞構(gòu)建成功.CCK-8細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果(圖5C)顯示,與轉(zhuǎn)染miR-145-3p mimic+pCDNA-vector的細(xì)胞比較,miR-145-3p mimic+pCDNA-MUC4的Hep3B細(xì)胞數(shù)明顯增加(P＜0.01).TUNEL染色結(jié)果(圖5D和E)顯示,與轉(zhuǎn)染miR-145-3p mimic+pCDNA-vector的細(xì)胞比較,miR-145-3p mimic+pCDNA-MUC4的Hep3B細(xì)胞的TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯減少(P＜0.01).以上結(jié)果表明:過(guò)表達(dá)MUC4能逆轉(zhuǎn)過(guò)表達(dá)miR-145-3p對(duì)細(xì)胞存活的抑制作用.

3 討論

近年來(lái),肝癌的發(fā)病率呈高速增長(zhǎng)趨勢(shì)[1,2],而肝癌的治療效果并不太理想.因此,需要進(jìn)一步研究肝癌治療的新策略,而研究肝癌發(fā)生與進(jìn)展機(jī)制可為肝癌的治療策略提供參考依據(jù).

miRNAs在包含腫瘤在內(nèi)的眾多疾病類型中發(fā)揮著重大作用.在肝癌中,也已發(fā)現(xiàn)許多miRNAs參與調(diào)控肝癌發(fā)生與進(jìn)展[9],但miRNAs成員眾多,依然有許多miRNAs未得到充分鑒定.miR-145-3p作為miRNAs成員之一,已被證明其在頭頸癌、肺癌和胃癌中發(fā)揮抑癌作用[6-8].本研究結(jié)果也顯示,miR-145-3p在肝癌組織和細(xì)胞中低表達(dá),且與T分期呈負(fù)相關(guān)關(guān)系,提示,miR-145-3p可能參與肝癌的進(jìn)展.為證明這一觀點(diǎn),本研究進(jìn)一步將miR-145-3p mimic或miR-145-3p inhibitor轉(zhuǎn)入Hep3B細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)miR-145-3p能抑制細(xì)胞增殖、周期轉(zhuǎn)換和促進(jìn)凋亡;而敲減miR-145-3p呈相反作用,這些結(jié)果說(shuō)明了,miR-145-3p在肝癌中發(fā)揮抑癌作用.

miRNA通過(guò)與靶基因的3’UTR區(qū)以堿基互補(bǔ)配對(duì)方式結(jié)合,來(lái)達(dá)到調(diào)節(jié)靶基因表達(dá),最終發(fā)揮后續(xù)生物學(xué)作用[5].因此本研究通過(guò)靶基因預(yù)測(cè)軟件targetScan 7.2篩選miR-145-3p潛在的靶基因,結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-145-3p與MUC4的3’UTR (142-148位點(diǎn))存在潛在的結(jié)合序列;且本研究進(jìn)一步通過(guò)點(diǎn)突變與熒光素酶法證明了MUC4是miR-145-3p的靶基因.已有研究表明,MUC4在多種腫瘤細(xì)胞中高表達(dá),且其高表達(dá)能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖與遷移[10,11].因此,本研究進(jìn)一步檢測(cè)miR-145-3p對(duì)MUC4表達(dá)的影響,結(jié)果顯示miR-145-3p能負(fù)調(diào)控靶基因MUC4的表達(dá).另外,本研究通過(guò)外源性引入MUC4過(guò)表達(dá)載體,發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)MUC4可解除過(guò)表達(dá)miR-145-3p對(duì)細(xì)胞存活的抑制作用.以上結(jié)果表明,miR-145-3p在肝癌中發(fā)揮抑癌作用可能與下調(diào)MUC4的表達(dá)相關(guān).

4 結(jié)論

綜上,本研究表明miR-145-3p在肝癌中表達(dá)降低,且過(guò)表達(dá)miR-145-3p可通過(guò)靶向MUC4來(lái)抑制肝癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)凋亡.另外本研究還表明miR-145-3p可能是肝癌的潛在治療靶點(diǎn).

文章亮點(diǎn)

實(shí)驗(yàn)背景

miRNAs在肝癌的發(fā)生與進(jìn)展中發(fā)揮著重要作用.目前有許多參與肝癌發(fā)生與進(jìn)展的miRNAs的功能并未得到鑒定.因此,繼續(xù)篩選并鑒定參與肝癌發(fā)生與進(jìn)展的miRNAs可能會(huì)為肝癌的診斷與治療提供靶點(diǎn).

實(shí)驗(yàn)動(dòng)機(jī)

miR-145-3p在頭頸癌、肺癌和胃癌中發(fā)揮抑癌作用,但其在肝癌中的表達(dá)模式和作用并不清楚.

實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)

探討miR-145-3p對(duì)肝癌細(xì)胞的增殖與凋亡的影響,并分析其機(jī)制.

實(shí)驗(yàn)方法

檢測(cè)miR-145-3p在不同T分期的肝癌組織和不同的肝癌細(xì)胞中的表達(dá)情況;進(jìn)一步研究過(guò)表達(dá)或敲減miR-145-3p表達(dá)對(duì)肝癌細(xì)胞的增殖與凋亡的影響,并分析其潛在的靶基因.

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

miR-145-3p在肝癌組織和肝癌細(xì)胞中低表達(dá).上調(diào)miR-145-3p能通過(guò)靶向4型黏蛋白來(lái)抑制肝癌細(xì)胞的增值并促進(jìn)凋亡.

實(shí)驗(yàn)結(jié)論

上調(diào)miR-145-3p能抑制肝癌細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡.

展望前景

上調(diào)miR-145-3p可能是肝癌的潛在的治療策略.