葉婷婷,張建芬,陳 虹

(浙江樹人大學生物與環(huán)境工程學院,浙江杭州 310015)

白腐真菌(White rot fungi)是一類高等擔子菌,主要包括栓菌屬(Trametes)、層孔菌屬(Phellinus)、木耳屬(Auricularia)、纖孔菌屬(Inonotus)、革蓋菌屬(Coriolus)、側(cè)耳屬(Pleurotus)和密孔菌屬(Pycnoporus)等[1]。白腐真菌是自然界中木質(zhì)素降解的主力軍,主要通過分泌胞外木質(zhì)素降解酶來實現(xiàn)[1]。其木質(zhì)素降解酶主要包括漆酶(Laccase)、木素過氧化物酶(Ligninperoxidase,LiP)和錳過氧化物酶(Manganese peroxidase,MnP)等三種[2]。漆酶是木質(zhì)素降解酶中研究最深入的一種,它是藍色多銅氧化酶家族中一類含銅的多酚氧化酶,具有良好的應用價值[3-5]。漆酶最早發(fā)現(xiàn)于漆樹中,后來發(fā)現(xiàn)其廣泛存在于植物、微生物中,而白腐真菌是漆酶的主要產(chǎn)生菌[3-5]。漆酶的底物作用范圍廣,在造紙、染料脫色、環(huán)境污染治理等方面具有巨大的應用潛力和廣闊的市場前景[6-8]。

近年來,染料在制革業(yè)、紡織業(yè)、造紙業(yè)和食品加工業(yè)中廣泛應用[9]。染料如未經(jīng)處理直接排放到環(huán)境中,會造成水體嚴重污染、危害水生生物和人類的健康[10]。白腐真菌及其漆酶處理是染料降解最為有效方式之一[9,11-15]。血紅栓菌(Trametessanguinea)又名血紅密孔菌(Pycnoporussanguineus),屬于多孔菌科、密孔菌屬[16]。一般生長于楊、柳、桂花等闊葉樹的枯木上,被害木材在初期為橘紅色,后期為白色腐朽[17]。該菌能夠產(chǎn)生包括漆酶在內(nèi)的多種木質(zhì)素降解酶[18-21]。

本研究從自然界中采集血紅栓菌的子實體,分離菌絲后,利用形態(tài)學觀察與分子生物學鑒定確定其分類學地位,優(yōu)化漆酶的發(fā)酵條件,利用其所產(chǎn)漆酶降解染料,為白腐真菌在染料廢水脫色的應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

真菌子實體 于2019年6月采自杭州西溪濕地,裝入無菌袋內(nèi)帶回實驗室,4 ℃冷藏保存;2,2′-聯(lián)氨-雙-(3-乙基-苯并噻唑啉-6-磺酸)二氨鹽(2,2′-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid),ABTS)、剛果紅、孔雀石綠和亞甲基藍 購于美國Sigma 公司;酒石酸銨、葡萄糖、KNO3、MgSO4、NaH2PO4、CuSO4、CaCl2、KCl、ZnSO4等 購于國藥集團化學試劑有限公司;小麥淀粉、馬鈴薯淀粉、木薯淀粉、馬鈴薯 市售產(chǎn)品。

LDZX-50KBS型立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠;YAMATO立式壓力蒸汽滅菌器、Eppendorf離心機、Xmark連續(xù)波長酶標儀 美國伯樂公司;MA100光學顯微鏡 尼康儀器(上海)有限公司、ZWY-1112D立式搖床 上海智城分析儀器制造有限公司;LRH-1500F生化培養(yǎng)箱 上海一恒科學儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養(yǎng)基的配制 PDA培養(yǎng)基(g/L):馬鈴薯200、葡萄糖20、瓊脂20?；A產(chǎn)酶培養(yǎng)基(g/L):玉米粉20、酵母粉5、MgSO40.5。

1.2.2 菌絲體的分離 菌株子實體采自杭州西溪濕地樹樁上。采用組織分離法分離真菌子實體的菌絲體。將新鮮菌株子實體表面消毒后,切成小塊后植入PDA平板上,于28 ℃培養(yǎng)。待長出菌絲后轉(zhuǎn)移至新鮮的PDA平板純化,多次純化直至獲得純菌株。

1.2.3 分離菌株的鑒定 形態(tài)鑒定:菌絲純培養(yǎng)經(jīng)PDA平板活化后轉(zhuǎn)接到新鮮的PDA平板中央,28 ℃培養(yǎng)5～7 d,觀察平板菌落形態(tài)。采用插片法,在光學顯微鏡下觀察菌株的菌絲形態(tài)和孢子形態(tài)。

分子鑒定:采用CTAB法提取菌株的基因組DNA。利用通用引物ITS1/ITS4進行PCR擴增。PCR反應為總體積25 μL體系,包括2×Taq Mastermix 12.5 μL,引物各1 μL,模板DNA1 μL。ITS區(qū)擴增程序:95 ℃預變性5 min;95 ℃變性40 min,54 ℃退火30 min,72 ℃延伸45 min,30個循環(huán);72 ℃延伸10 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)電泳分析后,委托上海生工生物有限公司進行測序。將測序的DNA序列提交GenBank進行BLAST比對,利用MEGA 7.0進行Clustal X多序列比對、Neighbor-Joining(NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,分析其同源關系,確立分類學地位。

1.2.4 菌株的發(fā)酵培養(yǎng)酶活性測定 以新鮮菌餅接種于PDA平皿上,28 ℃培養(yǎng)5 d。將菌餅接種到基礎產(chǎn)酶培養(yǎng)基中,28 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)。在接種的第6 d開始,每隔1 d取發(fā)酵液1 mL,10000 r/min離心5 min,上清液經(jīng)適當稀釋后測定其漆酶活性,以監(jiān)測其產(chǎn)酶峰值。

采用ABTS法測定漆酶酶活,反應體系為1 mL,含HAc-NaAc(pH4.5)緩沖溶液0.78 mL,稀釋后的酶液20 μL和1 mmol/L的ABTS 100 μL,每30 s在酶標儀上讀取一次420 nm下的吸光值。酶活力單位(U)定義:每分鐘內(nèi)催化1 μmol ABTS生成產(chǎn)物所需的酶量。漆酶酶活按文獻[22]公式計算,其中420 nm波長處ABTS摩爾消光系數(shù)ε420=3.6×104L/(mol·cm)。

1.2.5 漆酶發(fā)酵條件優(yōu)化 最適碳源:基礎產(chǎn)酶培養(yǎng)基中分別添加20 g/L的小麥淀粉、馬鈴薯淀粉和木薯淀粉作為碳源,培養(yǎng)基其它成分不變,28 ℃、150 r/min搖床培養(yǎng)6、7 d,測定發(fā)酵液漆酶酶活。

最適氮源:在確定最適碳源的基礎上,基礎產(chǎn)酶培養(yǎng)基中分別以5 g/L酵母粉、蛋白胨、硫酸銨、酒石酸銨、硝酸鈉為氮源,28 ℃、150 r/min搖床培養(yǎng)6、7 d,測定發(fā)酵液漆酶酶活。

誘導劑選擇:在確定碳、氮源種類的基礎上,在培養(yǎng)基中分別加入1 mmol/L的維生素B、愈創(chuàng)木酚、CuSO4和硫酸鎂作為誘導劑,以培養(yǎng)基不加誘導劑作為對照,28 ℃、150 r/min搖床培養(yǎng)7～9 d,測定發(fā)酵液漆酶酶活。

250 mL搖瓶裝液量:在確定培養(yǎng)基組成的基礎上,調(diào)節(jié)搖瓶裝液量分別為25、50、100、125、150 mL,28 ℃、150 r/min搖床培養(yǎng)7～9 d,測定發(fā)酵液漆酶酶活。

1.2.6 菌株的漆酶同工酶譜分析 采用10%的活性聚丙烯酰胺凝膠電泳(Native-PAGE)分析漆酶同工酶。分別取7.5和15 μL發(fā)酵液進行電泳分析,電泳后蛋白膠在1 mmol/L ABTS(HAc-NaAc,pH4.5緩沖液)溶液中染色20 min,分析其同工酶譜組分。

1.2.7 漆酶對染料的脫色作用 初始反應體系10 mL,由染料溶液(100 mg/L)、粗酶液(200 U/L)和0.1 mol/L的醋酸鈉緩沖液(pH4.5)組成。反應液在30 ℃恒溫振蕩水浴鍋中反應,每隔1 h取0.3 mL反應液分析,直至48 h。以加入等量滅活漆酶酶液的反應體系為對照,計算脫色率,脫色率按文獻[23]方法計算,即脫色率(%)=[(A0-At)/A0]×100(其中A0和At分別為反應0 h和t h的吸光度)。通過改變反應體系中的pH(2.8、3.2、3.6、4.0、4.4、4.8、5.2、5.6、6.0)和溫度(25、30、35、40、45、50、55、60 ℃),考察不同條件對脫色的影響。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每組實驗平行3次,采用Excel進行數(shù)據(jù)處理,采用Origin 8.0軟件進行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 真菌的分離鑒定

2.1.1 真菌的分離和形態(tài)鑒定 白腐真菌的采集:2019年6月16日上午,在浙江省杭州市西溪濕地的日本晚櫻樹上,采集到野生真菌子實體(命名為Strain H-1),用無菌信封裝好,于冰箱冷藏保存?zhèn)溆?。從子實體形態(tài)上可以初步判斷它是一種白腐真菌。

參照《中國野生大型真菌彩色圖鑒》[24]進行白腐真菌種類初步鑒定。采集到的白腐真菌如圖1A和圖1B所示,其菌蓋為扇形,菌蓋直徑達2～5 cm,厚2～4 mm,表面平滑,正面呈淺的暗橘紅色,反面呈鮮艷橘紅色。Strain H-1無菌柄,菌管為圓形且管口較為細小。根據(jù)Strain H-1子實體形態(tài)特征,初步鑒定其可能為紅栓菌。平板菌落形態(tài)如圖1C所示,Strain H-1在PDA平板上生長良好,長速較快,菌絲初期為白色絨毛狀,生長2～3 d后,菌絲呈現(xiàn)橘紅色。顯微鏡觀察如圖1D所示,Strain H-1的菌絲發(fā)達,透明且光滑,孢子卵圓形,透明。

圖1 白腐真菌Strain H-1的形態(tài)

2.1.2 白腐真菌的分子生物學鑒定 以Strain H-1的基因組DNA為模板,以ITS1和ITS4為引物,成功擴增了它的ITS區(qū)序列。如圖2所示,擴增產(chǎn)物電泳后呈現(xiàn)明亮整齊的單一條帶,片段大小為609 bp,基本符合ITS區(qū)序列大小,可以進一步用于測序。將它交由上海生工生物工程有限公司測序,將測得序列提交NCBI數(shù)據(jù)庫進行BLAST比對分析,結(jié)果表明:Strain H-1與TrametessanguineaMH142019.1(血紅栓菌/血紅色陀螺孔菌)同源性為99%以上。以GanodermalucidumKX358403.1(靈芝)為外群種構(gòu)建的進化樹見圖3,可知Strain H-1與菌株Trametessanguinea聚為一支,且親緣關系最近。前期形態(tài)鑒定實驗表明此野生白腐真菌可能為紅栓菌,分子鑒定、進化樹分析與形態(tài)鑒定結(jié)果相吻合。因此,Strain H-1鑒定為血紅栓菌TrametessanguineaH-1。

圖3 菌株H-1基于ITS序列的系統(tǒng)發(fā)育進化樹

圖2 ITS1區(qū)PCR擴增產(chǎn)物凝膠電泳圖

2.2 血紅栓菌產(chǎn)漆酶的培養(yǎng)條件優(yōu)化

2.2.1 碳源優(yōu)化 研究碳源對血紅栓菌H-1產(chǎn)漆酶的影響,結(jié)果如圖4所示,在培養(yǎng)至第6 d和第7 d時,以小麥淀粉為碳源,產(chǎn)漆酶的酶活力均最高,其次以馬鈴薯淀粉為碳源，而以木薯淀粉為碳源,產(chǎn)漆酶的酶活力最低。因此,選擇小麥淀粉為血紅栓菌H-1產(chǎn)漆酶的碳源。

圖4 碳源對血紅栓菌H-1發(fā)酵產(chǎn)漆酶的影響

2.2.2 氮源優(yōu)化 考察氮源對血紅栓菌H-1產(chǎn)漆酶的影響,結(jié)果如圖5所示,以酒石酸銨為氮源,血紅栓菌H-1產(chǎn)漆酶的酶活力最高,其次為硫酸銨。據(jù)文獻報道,以酒石酸銨為氮源,有利于白腐真菌產(chǎn)漆酶[23]，本文的實驗結(jié)果與文獻一致。以硝酸鈉為氮源,血紅栓菌H-1產(chǎn)漆酶的酶活力最低,說明血紅栓菌H-1對銨態(tài)氮的利用較好,而對硝態(tài)氮的利用較差。此外,以酵母粉和蛋白胨為氮源時,其漆酶酶活力都不高,說明血紅栓菌H-1對無機氮源的利用要優(yōu)于有機氮源。因此,選擇酒石酸銨為血紅栓菌H-1產(chǎn)漆酶的氮源。

圖5 氮源對血紅栓菌H-1發(fā)酵產(chǎn)漆酶的影響

2.2.3 誘導劑選擇 研究誘導劑對血紅栓菌H-1產(chǎn)漆酶的影響,結(jié)果如圖6所示,以硫酸銅為誘導劑,產(chǎn)漆酶的酶活力最高,遠遠高于其它誘導劑,其次為愈創(chuàng)木酚。漆酶是一種含銅的多酚氧化酶,銅離子位于其酶活中心,因此銅離子能誘導漆酶基因表達,從而調(diào)控漆酶的合成[23]。此外,愈創(chuàng)木酚等小分子酚類化合物對漆酶具有較好的誘導作用,也常用作誘導劑。劉文華等研究發(fā)現(xiàn)香蘭素和愈創(chuàng)木酚對Trameteshirsuta漆酶的分泌有促進作用[25]，本實驗結(jié)果與文獻報道的一致。因此,選擇硫酸銅為血紅栓菌H-1產(chǎn)漆酶的誘導劑。

圖6 誘導劑對血紅栓菌H-1發(fā)酵產(chǎn)漆酶的影響

2.2.4 搖瓶裝液量優(yōu)化 研究搖瓶裝液量對血紅栓菌H-1產(chǎn)漆酶的影響,結(jié)果如圖7所示,當250 mL搖瓶的裝液量分別為25 mL和100 mL時,漆酶酶活都比較高,考慮到培養(yǎng)量,選擇裝液量為100 mL發(fā)酵產(chǎn)漆酶。

圖7 搖瓶裝液量對血紅栓菌H-1發(fā)酵產(chǎn)漆酶的影響

經(jīng)優(yōu)化后,血紅栓菌H-1以小麥淀粉為碳源,酒石酸銨為氮源,以硫酸銅為誘導劑,250 mL搖瓶裝液量為100 mL,28 ℃、150 r/min搖床培養(yǎng)7 d,漆酶酶活力達到3527.8 U/L,比優(yōu)化前提高了約30倍。血紅栓菌H-1漆酶酶活力比文獻報道的略低[26],今后,還需進一步優(yōu)化其培養(yǎng)基配方和發(fā)酵培養(yǎng)條件。

2.3 血紅栓菌產(chǎn)漆酶的酶譜分析

采用10%的活性聚丙烯酰胺凝膠電泳(Native-PAGE)分析血紅栓菌H-1漆酶的同工酶,發(fā)酵上清液經(jīng)電泳后ABTS染色分析。結(jié)果如圖8所示,在大約45 kDa處,可見一清晰的綠色色帶,表明血紅栓菌H-1所產(chǎn)漆酶可能為單一蛋白,且分子量約為45 kDa。據(jù)報道[10],血紅密孔菌(PycnoporussanguineusMX5)3個漆酶同工酶Lacl、Lac2、Lac3均為單體蛋白,分子量分別為61.8、61.8和60.6 kDa。因此,不能排除本實驗血紅栓菌 H-1所產(chǎn)漆酶為多個分子量相近蛋白的可能。

圖8 漆酶的活性PAGE電泳分析

2.4 漆酶對染料的脫色研究

2.4.1 pH對漆酶脫色的影響 研究不同pH緩沖體系下,反應溫度30 ℃,血紅栓菌H-1漆酶對工業(yè)染料脫色的影響,結(jié)果如圖9所示,血紅栓菌漆酶對試驗三種染料均具有較好的脫色效果,在pH3.2(檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液)和pH5.2(醋酸-醋酸鈉緩沖液)附近,脫色效果均達到峰值。其中脫色效果最好的是剛果紅和孔雀石綠,在pH3.2和pH5.2時,剛果紅脫色率分別達到54.2%和65.4%,孔雀石綠脫色率分別達到61.1%和47.5%。在pH3.2和pH4.8時,血紅栓菌H-1漆酶對亞甲基藍的脫色率分別達到24.1%和31.3%。此外,在pH2.8～6.0之間,血紅栓菌H-1漆酶對試驗三種染料的脫色率有兩個峰值,其可能原因血紅栓菌H-1漆酶有2個或者多個同工酶,它們有不同的最適反應pH。據(jù)報道[10],血紅密孔菌(Pycnoporussanguineus),毛栓菌(Trameteshirsuta)等白腐菌有多個漆酶同工酶。

圖9 不同pH下漆酶對染料的降解

2.4.2 溫度對漆酶脫色的影響 研究不同溫度下,pH5.0,血紅栓菌H-1漆酶對工業(yè)染料脫色的影響,結(jié)果如圖10所示,血紅栓菌漆酶對亞甲基藍、剛果紅和孔雀石綠均具有較好的脫色效果,在30和50 ℃時,脫色效果均達到峰值,可能原因血紅栓菌H-1漆酶有多個同工酶,它們有不同的最適反應溫度。

圖10 不同溫度下漆酶對染料的降解

剛果紅是典型的雙偶氮染料[20],孔雀石綠是典型的三苯甲烷染料[14],亞甲基藍是典型的噻嗪染料[27],它們的化學性質(zhì)都比較穩(wěn)定,難以在自然環(huán)境中被降解,且具有高毒性、高殘留性和“三致”作用,它們能在環(huán)境中積累,并且通過食物鏈進入人體,嚴重危害人類健康[27]。本研究中,血紅栓菌H-1胞外漆酶對試驗的三種典型染料均有明顯的脫色作用,表明該漆酶在染料降解方面具有較大的應用前景。后續(xù)為進一步提高漆酶對染料的脫色效果,可考察在介體存在下,血紅栓菌H-1漆酶對染料的脫色作用。

3 結(jié)論

本文采用組織分離法從采集的白腐真菌子實體中分離菌絲體,通過形態(tài)學觀察和分子生物學法鑒定該白腐真菌為血紅栓菌(TrametessanguineaH-1)。通過單因素實驗優(yōu)化了血紅栓菌H-1產(chǎn)漆酶的培養(yǎng)條件,結(jié)果表明,得到的優(yōu)化培養(yǎng)基配方為:小麥淀粉20 g、玉米粉20 g、酒石酸銨5 g、MgSO40.5 g,CuS042 mmol/L。優(yōu)化的培養(yǎng)條件為:250 mL的搖瓶裝液量為100 mL,28 ℃條件下培養(yǎng)7 d,發(fā)酵液漆酶酶活為3527.8 U/L,比優(yōu)化前提高了約30倍。然后通過Native-PAGE分析血紅栓菌H-1漆酶的同工酶,結(jié)果顯示其漆酶可能為大小約45 kDa的單一蛋白。染料脫色實驗表明血紅栓菌H-1漆酶對三種染料均具有較好的脫色效果,在沒有介體存在下,在pH3.2和pH5.2附近,溫度為30和50 ℃時,脫色效果均達到峰值。剛果紅、孔雀石綠和亞甲基藍脫色率分別達到65.4%、47.5%和31.3%。從自然界分離到的血紅栓菌H-1能產(chǎn)生較高活性的漆酶,在染料廢水脫色的方面具有一定的應用前景。