魯程緋，郭志義△，魯弼嘉，李小倩，劉佳瑋

苯丙酮尿癥（phenylketonuria，PKU）是一種常見的新生兒氨基酸代謝障礙性疾病，屬于常染色體隱性遺傳疾病［1］。其發(fā)病機(jī)制主要是苯丙氨酸（phenylalanine，PA）代謝途中的苯丙氨酸羥化酶（phenylalanine hydroxylase，PAH）基因突變導(dǎo)致肝臟PAH缺乏或活性降低，使PA不能正常轉(zhuǎn)化為酪氨酸而引發(fā)的代謝性疾病［2-3］。其主要臨床表現(xiàn)為發(fā)育遲緩、精神亢進(jìn)、智力低下等，極大地影響了患者的生理健康［4］。PKU可根據(jù)其血中PA濃度分為經(jīng)典型和非經(jīng)典型兩種，其中經(jīng)典型占PKU患者總數(shù)的90%［5］。由于PAH在不同種族和地區(qū)發(fā)生的基因突變存在差異，各個國家和地區(qū)均有其突變特點。據(jù)統(tǒng)計，我國PKU發(fā)病率約為1/11 000，且絕大部分患者由PAH基因突變引發(fā)［6-7］。PAH是一種具有催化活性的四聚體，可催化人體肝臟中的PA轉(zhuǎn)化成酪氨酸，其編碼基因由13個外顯子（Exon）和12個內(nèi)含子構(gòu)成［8-9］。PKU前期癥狀不明顯，容易被忽略。因此，在出生后需通過前期篩查預(yù)防性治療才能避免病情惡化。本研究通過分析唐山市近4年來PKU患兒篩查結(jié)果，探討新生兒PAH基因突變的情況。

1 對象與方法

1.1研究對象 收集2015年1月—2018年12月唐山市婦幼保健院新生兒篩查中心接收的303 777例新生兒PKU篩查結(jié)果，所有樣本分別來自唐山市各市、縣、鎮(zhèn)級醫(yī)院。其中男163 243例，女140 534例。

1.2篩查方法 在新生兒出生后3 d內(nèi)，針刺采集足跟血于篩查濾紙上，晾干后通過茚三酮免疫熒光法檢測足跟血中PA含量，試劑盒購于芬蘭雷勃公司，相關(guān)操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。若PA初篩濃度≥120 μmol/L，提示為可疑陽性，篩查人員通過電話或短信的形式通知可疑陽性患兒家長帶回復(fù)查。若復(fù)查PA濃度仍≥120 μmol/L，則可確診為PKU。

1.3聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）檢測PAH基因 采用酚-氯仿提取外周血DNA，提取后置于-20℃保存。參照文獻(xiàn)［10］進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，引物序列：Exon2上游 5′-AGAGTTCATGCTTGCTTTG-3′，下游 5′-TGGAAGTTTGCTACGACAT-3′；Exon3上 游 5′-GTTAGGTTTTCCTGTTCTGGT-3′，下 游 5′-TGTGGAGTTACTTATGTTGCA-3′；Exon6上 游 5′-CCCCGACTC CCTCTGCTAA-3′，下游 5′-CCTCTGCCTCAATCCTCCC-3′；Exon7上 游 5′-GTCTCCTAGTGCCTCTGACT-3′，下 游 5′-GCAATGAACCCAAACCTC-3′；PCR擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，60℃復(fù)性30 s，73℃延伸50 s，共循環(huán)32次，72℃10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖檢測并純化后委托生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行雙向測序。

2 結(jié)果

2.1 唐山市新生兒PKU篩查情況分析 303 777例PKU篩查的新生兒中，初步篩查結(jié)果有609例可疑陽性，共召回411例（67.49%）進(jìn)行復(fù)查，確診42例（13.8/10萬）。見表1。

Tab.1 PKU screening of newborns in Tangshan from 2015 to 2018表1 2015—2018年唐山市新生兒PKU篩查情況

2.2 唐山市新生兒PAH基因突變情況分析 42例PKU患者的PAH基因測序顯示，在84條染色體上共檢測到62個（73.81%）突變位點。所有患者均檢測出突變基因，其中20例患者檢測出2個突變位點，22例患者檢測出1個突變位點。所有患者共檢測出12種突變，其中錯義突變8種，無義突變2種，缺失突變1種，剪接突變1種?；颊呋蛲蛔兎植荚诘?、3、6、7、9外顯子上，其中第7外顯子最多，共35個（56.45%）；其次為第3外顯子14個（22.58%）。唐山市常見突變基因分別為Exon7-R243Q（18個，29.03%）、Exon3-R111X（10個，16.13%）和 Exon7-R261Q（10個，16.13%）。見表2。

Tab.2 PAH gene mutation in Tangshan City表2 唐山市PAH基因突變情況

2.3 典型案例分析 1例女性患兒，在PAH基因外顯子區(qū)域同時發(fā)現(xiàn)2處雜合突變：c.208-210delTCT（缺失突變），導(dǎo)致氨基酸改變p.S70del（缺失突變），根據(jù)美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會（ACMG）指南，該突變變異類型可評級為Pathogenic（致病突變）；c.964G＞A（鳥嘌呤＞腺嘌呤），導(dǎo)致氨基酸改變p.A322T（丙氨酸＞蘇氨酸），根據(jù)ACMG指南，該突變變異類型可評級為Likely pathogenic（疑似致病突變）。見圖1。

Fig.1 Sanger sequence of two gene mutations in a typical PKU child and his parents圖1 1例典型PKU患兒及其父母的兩個基因突變受檢位點Sanger測序圖

3 討論

PKU是由遺傳因素導(dǎo)致基因缺陷引發(fā)的遺傳代謝性疾病，尤其是近親結(jié)婚會增加下一代的發(fā)病風(fēng)險。目前，基因診斷是產(chǎn)前診斷PKU的唯一方法，基因診斷能夠有效避免PKU患兒的出生，及時發(fā)現(xiàn)并對已生育的PKU患兒加以治療，從而緩解其病情［11-12］?，F(xiàn)已知的PAH基因突變類型多種多樣，其中以錯義突變居多，約占60.08%，其次為缺失突變（13.35%）和剪切突變（11.03%）［13-14］。PAH基因突變類型、位點在不同種族和地區(qū)之間均有差異。目前發(fā)現(xiàn)PAH突變在每個外顯子上均能發(fā)生，但主要集中在3、6、7和11外顯子上，且隨著地區(qū)的不同其發(fā)生頻率也不同［15］。

本研究結(jié)果顯示，唐山市在2015—2018年間共確診PKU 42例，發(fā)病率為13.8/10萬，略高于全國PKU發(fā)病率1/11 000。分析其原因之一為不同國家和地區(qū)的PAH突變類型、位點等諸多因素不同［16］。本研究中42例PKU患兒84條染色體上共檢測到62個（73.81）突變。患兒PAH基因中共檢測到12種突變 ，以 Exon7-R243Q（29.03%）、Exon3-R111X（16.13%）和 Exon7-R261Q（16.13%）為主。其中R243Q在本市患兒中出現(xiàn)頻率最高，與國內(nèi)大部分研究［17］相一致，但出現(xiàn)頻率相對高于報道的河南地區(qū)人群（18.14%）［18］和新疆地區(qū)人群（21.8%）［19］，提示R243Q是我市PKU患兒的突變熱點基因。本研究結(jié)果顯示，患兒PAH基因突變多出現(xiàn)于第7外顯子上，共35次（56.45%），與其他國內(nèi)外研究［20］結(jié)果相一致，說明第7外顯子也是我市患兒PAH基因高頻突變位點。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)1例典型病例，該患兒在PAH基因外顯子區(qū)域出現(xiàn)2處雜合突變：c.208-210delTCT（缺失突變），導(dǎo)致氨基酸改變p.S70del（缺失突變），根據(jù)ACMG指南，該突變變異類型可評級為Pathogenic（致病突變）；c.964G＞A（鳥嘌呤＞腺嘌呤），導(dǎo)致氨基酸改變p.A322T（丙氨酸＞蘇氨酸），根據(jù)ACMG指南，該突變變異類型可評級為Likely pathogenic（疑似致病突變）。查閱相關(guān)文獻(xiàn)，暫未發(fā)現(xiàn)與本案例相一致的報道。

綜上，唐山市2015—2018年P(guān)KU發(fā)病率為13.8/10萬，略高于全國發(fā)病率，PAH基因變異以錯義突變?yōu)橹?，且?外顯子是唐山市患兒PAH基因高頻突變位點，R243Q出現(xiàn)頻率最高且高于國內(nèi)其他地區(qū)。