劉曉蘭，張永忠，張俊玲，聶曉博，賈琳，劉會麗△

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種慢性非特異性結(jié)腸炎癥性疾病，其發(fā)病機制尚不清楚。近年來研究發(fā)現(xiàn)，細胞自噬與炎癥細胞因子相互作用造成腸道內(nèi)環(huán)境紊亂，可能是引起慢性腸道炎癥的原因之一［1-2］。蒼術(shù)為中醫(yī)臨床治療UC的常用藥材，揮發(fā)油為其主要有效成分［3］。本研究對蒼術(shù)揮發(fā)油干預(yù)大鼠實驗性UC的作用進行觀察，并從細胞自噬基因和炎癥反應(yīng)角度探討本藥對UC的保護作用機制。

1 材料與方法

1.1材料 SPF級雄性SD大鼠85只，7～9周齡，體質(zhì)量（200±20）g，購自斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司，實驗動物許可證號SCXK（京）2019-0010。蒼術(shù)購自河北省中醫(yī)院，經(jīng)醫(yī)院藥劑科鑒定為菊科植物茅蒼術(shù)［Atractylodeslancea（Thunb.）DC.］；以水蒸氣蒸餾法提取其中揮發(fā)油性成分，出油率為4.5%；實驗時配成0.4 g生藥/mL，存儲于-4℃。美沙拉嗪購自上海艾迪發(fā)制藥有限公司（批號171013）。2，4，6-三硝基苯磺酸（TNBS）5%（W/V）水溶液購自美國Sigma公司，使用前用50%乙醇配成10%（W/V）溶液。大鼠白細胞介素（IL）-6、腫瘤壞死因子（TNF）-α酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒購自上海森雄科技實業(yè)有限公司。SYBR?Green Master Mix購自美國Thermo公司，微管相關(guān)蛋白1輕鏈3（LC3）兔抗大鼠多克隆抗體（ab51520）購自英國Abcam公司；實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（qPCR）引物由生工生物工程（上海）有限公司合成，序列見表1。

Tab.1 Sequences of primers for qPCR表1qPCR引物序列

1.2實驗方法

1.2.1模型制備 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后，禁食12 h。乙醚輕度麻醉后將直徑為2 mm的無菌聚乙烯管插入肛門，深約8cm，將0.25 mL TNBS溶液灌入，結(jié)束后維持肛門高位約30 s。另取10只大鼠作為空白對照組，用0.25 mL生理鹽水灌腸。模型制備后第5天，若見大鼠大便次數(shù)增多，且多為稀便或黏液便，動物體質(zhì)量減輕，精神萎靡不振則為模型制備成功，實驗共制備模型75只，成功50只（67%）。

1.2.2分組與給藥 模型制備后第6天，將模型制備成功的大鼠編號后按照隨機數(shù)字表法分為5組，分別為模型組、陽性對照組、高劑量組、中劑量組和低劑量組，每組10只。實驗按照體表面積比，用人體臨床劑量折算出大鼠的劑量，對應(yīng)的高、中、低劑量組每日分別灌胃蒼術(shù)揮發(fā)油4、2及1 g生藥/kg體質(zhì)量，陽性對照組每日灌胃美沙拉嗪0.36 g/kg體質(zhì)量，每日1次，每次10 mL/kg，連續(xù)10 d。空白對照組和模型組大鼠每日灌胃等體積蒸餾水。

1.2.3體質(zhì)量檢測及取材 模型制備前、給藥前和末次給藥后分別記錄大鼠體質(zhì)量，觀察一般情況和糞便性狀。末次給藥后，大鼠禁食12 h。將大鼠麻醉后，仰面固定，開腹，快速剪取結(jié)腸，部分用10%福爾馬林固定，剩余部分快速置于液氮中凍存。

1.2.4蘇木精-伊紅（HE）染色觀察結(jié)腸病理形態(tài) 將甲醛固定的結(jié)腸以石蠟包埋，切成4 μm薄片，常規(guī)HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察形態(tài)學(xué)變化。

1.2.5ELISA檢測結(jié)腸組織中IL-6和TNF-α含量 將所取結(jié)腸組織約500 mg在勻漿管中勻漿，用ELISA法檢測IL-6和TNF-α含量。

1.2.6qPCR檢測結(jié)腸組織中Beclin 1和P62mRNA表達水平 取約200 mg結(jié)腸組織在液氮中充分研磨，Trizol法提取RNA，測定濃度和純度后反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。最后加入相應(yīng)的引物和SYBR?Green Master Mix后擴增，擴增條件：50℃2min；95 ℃ 2 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，45個循環(huán)。記錄Ct值后采用2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量。

1.2.7Western blot法檢測結(jié)腸組織中LC3水平 取約500 mg結(jié)腸組織，加入2 mL蛋白裂解液、2 μL蛋白酶抑制劑和2 μL磷酸酶抑制劑，均漿，離心后取上清，進行蛋白質(zhì)含量測定。配制10%SDS PAGE凝膠，取約30 μg上樣，120 V恒壓電泳約2 h。轉(zhuǎn)膜后以5%BSA封閉2 h，分別加入1∶1 000稀釋的一抗液4℃過夜。次日加入1∶10 000稀釋的二抗，室溫孵育1 h后化學(xué)發(fā)光，以LC3Ⅱ和LC3Ⅰ的光密度比值作為LC3蛋白相對表達量。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)采用SPSS 23.0進行統(tǒng)計分析，符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標(biāo)準差（±s）表示。多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 6組大鼠體質(zhì)量變化 模型制備前各組大鼠體質(zhì)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。給藥前，模型組和各給藥組間體質(zhì)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），但均低于空白對照組（P＜0.05）。給藥后，與空白對照組相比，模型組大鼠和低、中、高劑量組大鼠體質(zhì)量均明顯降低（P＜0.05），陽性對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；與模型組相比，蒼術(shù)揮發(fā)油中、高劑量組和陽性對照組大鼠體質(zhì)量升高（P＜0.05），低劑量組差異則無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；與低劑量組相比，高劑量組和陽性對照組大鼠體質(zhì)量顯著提高（P＜0.05），中劑量組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表2。

Tab.2 The changes of body weights during the experiment in six groups表2 6組大鼠實驗期間體質(zhì)量變化 （n=10，g，±s）

Tab.2 The changes of body weights during the experiment in six groups表2 6組大鼠實驗期間體質(zhì)量變化 （n=10，g，±s）

＊＊P＜0.01；a與空白對照組比較，b與模型組比較，c與低劑量組比較，均 P＜0.05；表2～4，圖2同

組別空白對照組模型組低劑量組中劑量組高劑量組陽性對照組F模型制備前156.66±14.84 158.89±17.08 161.50±8.78 149.20±10.21 159.10±12.28 160.20±16.05 1.017給藥前197.11±20.47 165.22±13.07a 164.50±18.72a 158.70±14.83a 159.30±18.47a 165.60±11.55a 7.061＊＊給藥后228.88±20.93 180.11±11.66a 191.63±19.79a 202.40±13.68ab 210.30±18.80abc 217.50±21.90bc 8.497＊＊

Fig.1 The pathological changes of colon tissues in six groups of rats(HE staining,×400)圖1 6組大鼠結(jié)腸組織病理學(xué)變化（HE染色，×400）

2.2 6組大鼠結(jié)腸形態(tài)變化 光鏡下可見，空白對照組大鼠結(jié)腸黏膜的上皮細胞完整，隱窩排列整齊（圖1A）；模型組大鼠結(jié)腸黏膜上皮細胞脫落，隱窩扭曲或萎縮，可見炎癥細胞浸潤（圖1B）；陽性對照組大鼠結(jié)腸上皮細胞僅有輕微損傷，隱窩排列規(guī)則（圖1C）。以蒼術(shù)揮發(fā)油治療，各劑量組均表現(xiàn)出不同程度上皮細胞雖有脫落或隱窩扭曲，但程度較模型組減輕（圖1D、E、F）。

2.3 6組大鼠結(jié)腸組織IL-6和TNF-α含量比較 與空白對照組相比，模型組大鼠結(jié)腸組織IL-6和TNF-α含量升高（P＜0.05）；與模型組相比，蒼術(shù)揮發(fā)油中、高劑量組和陽性對照組大鼠結(jié)腸組織IL-6和TNF-α含量下降（P＜0.05），低劑量組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。與低劑量組相比，高劑量組和陽性對照組結(jié)腸組織IL-6含量明顯降低（P＜0.05），中劑量組、高劑量組和陽性對照組的TNF-α含量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表3。

Tab.3 The changes of IL-6 and TNF-α levels in colon tissues of the six groups表3 6組大鼠結(jié)腸組織IL-6和TNF-α含量的變化（n=10，±s）

Tab.3 The changes of IL-6 and TNF-α levels in colon tissues of the six groups表3 6組大鼠結(jié)腸組織IL-6和TNF-α含量的變化（n=10，±s）

組別空白對照組模型組低劑量組中劑量組高劑量組陽性對照組F IL-6（ng/g）12.85±4.03 22.22±2.81a 21.21±5.24a 18.14±4.69ab 16.83±4.72abc 16.95±4.13abc 5.398＊＊TNF-α（ng/g）15.70±2.87 26.06±3.00a 23.47±2.58a 22.30±4.73ab 20.83±3.56ab 20.52±2.44ab 9.762＊＊

2.4 6組大鼠結(jié)腸組織中Beclin 1和P62mRNA表達水平變化 與空白對照組相比，模型組大鼠結(jié)腸組織中Beclin 1和P62mRNA表達水平升高（P＜0.05）。與模型組相比，蒼術(shù)揮發(fā)油高劑量組和陽性對照組Beclin 1和P62 mRNA表達明顯升高（P＜0.05），中劑量組Beclin 1mRNA表達升高（P＜0.05），低劑量組的Beclin 1、P62mRNA和中劑量組的P62mRNA表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。與低劑量組相比，高劑量組和陽性對照組的Beclin 1、P62mRNA表達顯著升高（P＜0.05），中劑量組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表4。

Tab.4 Comparison of the Beclin 1 and P62 mRNA expression levels in colon tissues between the six groups表4 6組大鼠結(jié)腸組織中Beclin 1和P62 mRNA表達水平比較 （n=10，±s）

Tab.4 Comparison of the Beclin 1 and P62 mRNA expression levels in colon tissues between the six groups表4 6組大鼠結(jié)腸組織中Beclin 1和P62 mRNA表達水平比較 （n=10，±s）

組別空白對照組模型組低劑量組中劑量組高劑量組陽性對照組F Beclin 1 mRNA 0.91±0.34 2.32±0.53a 3.49±1.15a 4.70±1.24ab 5.54±1.24abc 8.40±1.05abc 21.059＊＊P62 mRNA 0.76±0.21 3.94±0.63a 4.93±0.79a 6.67±1.35a 14.67±2.46abc 19.64±2.70abc 57.222＊＊

2.5 6組大鼠結(jié)腸組織中LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表達水平變化 與空白對照組相比，模型組大鼠結(jié)腸組織中LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），蒼術(shù)揮發(fā)油低、中、高劑量組和陽性對照組大鼠結(jié)腸組織中LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表達均顯著上調(diào)（P＜0.05）。與模型組相比，蒼術(shù)揮發(fā)油中劑量組、高劑量組和陽性對照組大鼠結(jié)腸組織中LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表達均顯著上調(diào)（P＜0.05），低劑量組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。與低劑量組相比，高劑量組和陽性對照組的LC3II/I蛋白表達顯著上調(diào)（P＜0.05），中劑量組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見圖2。

Fig.2 Changes of the LC3 Ⅱ/Ⅰ protein expression levels in colon tissues of the six groups圖2 6組大鼠結(jié)腸組織中LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表達水平變化

3 討論

UC是結(jié)腸黏膜層和黏膜下層的連續(xù)性炎癥反應(yīng)，其病變主要累及直腸和遠端結(jié)腸，可引起腹痛、腹瀉及黏液膿血便。雖已經(jīng)過多年研究，但其發(fā)病機制至今仍未完全清楚，多數(shù)學(xué)者認為本病與自身免疫異常有關(guān)［4］，而巨噬細胞在機體的免疫調(diào)節(jié)中充當(dāng)著重要的角色。巨噬細胞可通過自噬與溶酶體相結(jié)合等方式吞噬、消化過多的蛋白質(zhì)以及衰老、變性、受損的細胞器，實現(xiàn)機體物質(zhì)再循環(huán)，維持細胞代謝平衡和內(nèi)穩(wěn)態(tài)［5-6］。在腸道炎癥反應(yīng)過程中，炎癥細胞因子IL-6、TNF-α等大量分泌，誘導(dǎo)自噬功能缺乏的腸上皮細胞凋亡，使腸道屏蔽功能降低，病變加重［7］。而自噬的形成和調(diào)節(jié)是受相關(guān)基因嚴格調(diào)控的復(fù)雜過程。Beclin 1是哺乳動物參與自噬的特異性基因，能介導(dǎo)自噬相關(guān)蛋白在自噬泡上定位，調(diào)控自噬體的形成與成熟，其表達上調(diào)能夠刺激自噬的發(fā)生［8］。P62則是自噬機制和自噬底物之間的適配器，常被用作檢測自噬通路通暢與否［9］。LC3是分布于自噬體膜上的標(biāo)記蛋白，多以LC3Ⅰ和LC3Ⅱ的形式共存。原本散布于細胞質(zhì)中的LC3Ⅰ在自噬體形成后會通過偶聯(lián)磷酸酰乙醇胺形成LC3Ⅱ，定位于自噬體的膜上，直至與溶酶體融合，因此LC3Ⅱ/Ⅰ在一定程度上反映了機體的自噬水平［10］。本研究中，通過5%TNBS灌腸制備UC模型大鼠，可見結(jié)腸組織中IL-6、TNF-α等炎癥因子水平升高，結(jié)腸組織中Beclin 1和P62表達上調(diào)，LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表達上調(diào)，均表明UC大鼠自噬功能受到抑制，腸道內(nèi)環(huán)境紊亂，與臨床報道相一致［11-12］。

目前臨床UC常以水楊酸制劑、糖皮質(zhì)激素類藥物治療，雖有一定療效，但不良反應(yīng)較大，限制了其應(yīng)用。近年來，中醫(yī)藥治療UC因療效顯著，不良反應(yīng)輕微而受到關(guān)注。中醫(yī)認為UC病機是由于機體正氣虛衰，陰陽失衡，造成體內(nèi)“濕”“熱”“瘀”邪兼夾轉(zhuǎn)化，邪伏于里，出現(xiàn)纏綿難愈的表現(xiàn)［13］。從現(xiàn)代醫(yī)學(xué)角度來看，UC“正虛邪實”可能與機體免疫功能低下引起的自噬功能異常，炎性因子堆積有關(guān)［14］。蒼術(shù)為常用芳香化濕藥，具有燥濕健脾，祛風(fēng)散寒功效，臨床常以蒼術(shù)為君藥治療UC［15］。寧海榮等［16］研究發(fā)現(xiàn)蒼術(shù)水煎液具有抗大鼠UC的作用，其機制與抗氧化、抑制腸道氧化應(yīng)激損傷有關(guān)。本研究結(jié)果表明，蒼術(shù)揮發(fā)油對大鼠結(jié)腸組織損傷有明顯保護作用，其作用與抑制IL-6、TNF-α釋放，上調(diào)自噬基因Beclin1、P62mRNA表達和LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表達有關(guān)。