詹倩，杜麗君，戴曦，袁競(jìng)，劉賁，王榮麗△

支氣管哮喘（asthma）是一種由多種細(xì)胞及細(xì)胞組分參與的氣道慢性炎癥性疾病，是最常見(jiàn)的慢性呼吸系統(tǒng)疾病之一，有3億多兒童和成人患病［1］。哮喘的具體機(jī)制尚不完全清楚，免疫反應(yīng)導(dǎo)致樹(shù)突狀細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞等浸潤(rùn)氣道黏膜下層，產(chǎn)生一系列病理過(guò)程是目前的主流觀點(diǎn)［2］。白細(xì)胞介素（IL）-25在哮喘氣道炎癥中發(fā)揮重要作用。IL-25不僅可誘導(dǎo)典型的嗜酸性炎癥和氣道高反應(yīng)性［3］，還可促進(jìn)杯狀細(xì)胞增生、上皮下膠原沉積和血管生成，最終導(dǎo)致氣道重構(gòu)［4］，杯狀細(xì)胞增生是導(dǎo)致氣道黏液高分泌的重要環(huán)節(jié)。過(guò)度產(chǎn)生的黏蛋白聚集在氣道導(dǎo)致阻塞，顯著增加哮喘患者，尤其是重癥患者的病死率［5］。血紅素氧合酶-1（hemeoxygenase，HO-1）是血紅素分解代謝的限速酶，也是一種應(yīng)激反應(yīng)蛋白［6］，廣泛參與機(jī)體炎癥反應(yīng)，具有抗氧化，保護(hù)重要組織、器官和細(xì)胞的功能［7］。然而，HO-1在哮喘中的抗炎作用機(jī)制尚不完全清楚。血晶素是一種高效HO-1敏化劑，能有效促進(jìn)體內(nèi)HO-1的釋放和表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察血晶素在哮喘小鼠模型中的作用，進(jìn)一步探討HO-1與IL-25誘導(dǎo)的氣道炎癥和黏液高分泌的關(guān)系，以期發(fā)掘新的哮喘病理機(jī)制和診療靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料 6～8周齡SPF級(jí)雌性Balb/c小鼠28只，體質(zhì)量18～22 g，購(gòu)自重慶騰鑫比爾實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，在西南醫(yī)科大學(xué)SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)，維持室溫在（22±1）℃、相對(duì)濕度40%～50%，晝夜光照節(jié)律，自由進(jìn)食及飲水。卵清蛋白（OVA）、血晶素（Hemin）均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；福多司坦片（Fudosteine）購(gòu)自江蘇正大豐海公司；兔抗鼠黏蛋白5AC（MUC5AC）多克隆抗體、生物素化山羊抗兔IgG購(gòu)自北京博奧森公司；IL-25、MUC5AC酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）試劑盒均購(gòu)自中國(guó)上海西唐生物公司；酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；高速離心機(jī)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；光學(xué)顯微鏡購(gòu)自日本OLYMPUS公司；BQ-318石蠟切片機(jī)購(gòu)自湖北伯納醫(yī)療公司。

1.2方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)分組 將28只小鼠根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法分成4組：對(duì)照組、哮喘組、血晶素組、福多司坦組，每組7只。

1.2.2干預(yù)方案 （1）哮喘組、血晶素組和福多司坦組小鼠于第1天和第14天腹腔注射 20 μg OVA+500 μg Al（OH）3+0.2 mL PBS致敏，第25、26、27、28天，將小鼠置于封閉的塑料盒（26 cm×19 cm×17 cm）中，用5%OVA溶液經(jīng)超聲霧化吸入激發(fā)氣道高反應(yīng)制備小鼠哮喘模型，每日1次，每次持續(xù)30min，對(duì)照組均以等量生理鹽水代替。（2）血晶素組致敏前1、2 d，致敏后12、13、23、24、27 d腹腔注射血晶素75 μmol/kg。（3）福多司坦組分別于致敏前25、26、27 d灌胃給藥福多司坦（200 mg/kg）。

1.2.3標(biāo)本收集 各組小鼠于末次激發(fā)后24 h內(nèi)用戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，眼眶取血并處死小鼠，收集的血液于4℃，1 500 r/min條件下離心10 min，取上清液置于-80℃冰箱保存；左肺組織以4%多聚甲醛固定用于HE染色及免疫組化染色；右肺組織保存于-80℃冰箱備用。

1.2.4組織病理學(xué)觀察 左肺組織用4%多聚甲醛固定24h，標(biāo)本脫水、石蠟包埋、5 μm連續(xù)切片，常規(guī)行HE染色，顯微鏡下觀察病理形態(tài)學(xué)改變。

1.2.5免疫組化染色檢測(cè)肺組織中MUC5AC的表達(dá) 取處死后小鼠肺組織，用4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖溶液固定48 h，流水沖洗30 min后，梯度乙醇脫水，石蠟包埋、切片，采用鏈霉素過(guò)氧化物酶（SP）法，抗原修復(fù)后，滴加兔抗鼠抗MUC5AC抗體（1∶100）4℃孵育過(guò)夜，室溫復(fù)溫漂洗后，滴加生物素標(biāo)記二抗37℃孵育30 min，PBS沖洗3次，DAB顯色，復(fù)染、脫水、透明封片后光鏡下觀察MUC5AC表達(dá)情況，以胞漿棕黃染色為陽(yáng)性反應(yīng)，應(yīng)用Image-Pro Plus圖像處理系統(tǒng)測(cè)量MUC5AC的平均吸光度值。

1.2.6ELISA法檢測(cè)IL-25、MUC5AC表達(dá)水平 將ELISA試劑盒于室溫下放置半小時(shí)，取出預(yù)先凍存于-80℃冰箱的血清和肺組織，置于冰上融化，按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)操作測(cè)定血清中IL-25表達(dá)水平。每份肺組織中加入1 mL PBS，置于研缽中，冰上研磨肺組織，收集勻漿，4℃，1 500 r/min條件下離心20 min，收集上清。按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)操作測(cè)定肺組織中MUC5AC的水平。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組樣本間的比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組肺組織形態(tài)學(xué)改變觀察 對(duì)照組氣道上皮結(jié)構(gòu)完整，未見(jiàn)明顯結(jié)構(gòu)改變及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。哮喘組肺組織可見(jiàn)大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、氣管黏膜增厚、黏膜下水腫。血晶素組和福多司坦組可見(jiàn)少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及滲出，病理改變較哮喘組輕，見(jiàn)圖1。

2.2 免疫組化染色檢測(cè)各組肺組織MUC5AC的表達(dá) 與對(duì)照組相比，哮喘組肺組織MUC5AC的表達(dá)明顯增加（P＜0.05）。在支氣管、支氣管上皮細(xì)胞、氣道基底層、肺泡間隔血管周?chē)庶S色、棕色或褐色強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)；與哮喘組相比，血晶素組和福多司坦組肺組織黃染明顯減弱，MUC5AC的表達(dá)明顯降低，且血晶素組較福多司坦組降低更明顯（P＜0.05），見(jiàn)圖2、3。

Fig.1 Histological observation of lung tissues of mice(HE,×200)圖1 各組小鼠肺組織形態(tài)學(xué)觀察（HE，×200）

Fig.2 The expressions of MUC5AC in lung tissues of mice(IHC,×200)圖2 各組肺組織中MUC5AC的表達(dá)情況（免疫組化，×200）

Fig.3 The average OD-value of MUC5AC positive expression cells in lung tissues of mice in each group by immunohistochemical staining圖3 各組小鼠肺組織免疫組化染色MUC5AC陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞的平均光密度值

2.3 ELISA法檢測(cè)各組肺組織MUC5AC和血清IL-25水平 與對(duì)照組相比，哮喘組、血晶素組、福多司坦組MUC5AC和IL-25的表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05）；與哮喘組相比，血晶素組和福多司坦組MUC5AC和IL-25降低，且血晶素組較福多司坦組降低更明顯（P＜0.05），見(jiàn)表1。

Tab.1 Contents of IL-25 in serum and MUC5AC in lung tissues表1 各組肺組織MUC5AC和血清中IL-25含量（n=7，ng/L，±s）

Tab.1 Contents of IL-25 in serum and MUC5AC in lung tissues表1 各組肺組織MUC5AC和血清中IL-25含量（n=7，ng/L，±s）

＊P＜0.05；a與對(duì)照組比較；b與哮喘組比較；c與血晶素組比較，P＜0.05

組別對(duì)照組哮喘組血晶素組福多司坦組F MUC5AC 79.27±9.85 238.90±14.15a 107.32±8.86ab 154.94±13.44abc 245.945＊IL-25 45.90±6.22 175.25±10.60a 77.91±10.05ab 116.45±10.82abc 234.822＊

2.4 MUC5AC與IL-25的相關(guān)性分析 MUC5AC與IL-25的表達(dá)水平呈正相關(guān)（r=0.932，P＜0.01），見(jiàn)圖4。

Fig.4 The correlation analysis of MUC5AC in lung tissue and IL-25 in serum圖4 血清中IL-25和肺組織中MUC5AC的相關(guān)性分析

3 討論

哮喘被認(rèn)為是由2型輔助性T細(xì)胞（Th2）介導(dǎo)的免疫功能紊亂引起，可導(dǎo)致氣道慢性炎癥、黏液分泌過(guò)多和細(xì)胞凋亡［8-9］。其中，氣道黏液高分泌是許多哮喘患者的共同特點(diǎn)，黏液阻塞被認(rèn)為是致死性哮喘氣道阻塞的機(jī)制之一［10］。因此，減少氣道黏液的產(chǎn)生和分泌是控制和治療哮喘的重要手段。HO-1是熱休克蛋白（HSP）家族的一員，其生理功能與血紅素分解代謝中的酶活性有關(guān)，其抗氧化和抗炎特性在多種炎癥疾病中發(fā)揮著不可或缺的作用［11］。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究顯示，HO-1可減輕肺和其他器官的過(guò)敏性炎癥，抑制Th2和Th17細(xì)胞分化［12-13］。Chen等［14］發(fā)現(xiàn)，HO-1可能通過(guò)氧化應(yīng)激途徑、轉(zhuǎn)錄因子和免疫細(xì)胞功能介導(dǎo)變態(tài)反應(yīng)。HO-1不僅具有抗炎作用，還可通過(guò)靶向哮喘的促炎性核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3-視黃醇X受體（NLRP3-RXR）軸保護(hù)氣道上皮細(xì)胞免于凋亡［15］。Lee等［16］研究發(fā)現(xiàn)HO-1的上調(diào)可減弱OVA誘導(dǎo)的哮喘小鼠活性氧的產(chǎn)生。但目前HO-1對(duì)于哮喘小鼠黏蛋白表達(dá)的影響研究較少。本研究結(jié)果顯示，與哮喘組比較，血晶素組及福多司坦組氣道炎癥細(xì)胞與管腔分泌物明顯減少，氣道上皮結(jié)構(gòu)相對(duì)完整，黏膜下水腫減輕，提示血晶素及福多司坦可改善支氣管哮喘氣道炎癥及黏液分泌，減輕哮喘炎癥反應(yīng)。

慢性氣道炎癥和黏液高分泌是哮喘氣道重塑的主要病理標(biāo)志，導(dǎo)致嚴(yán)重哮喘患者的肺功能降低和死亡風(fēng)險(xiǎn)增加［17-18］。黏液是由一種被稱(chēng)為黏液素的高度糖基化的蛋白質(zhì)組成，其中MUC5AC和黏蛋白5B（MUC5B）是參與哮喘的主要黏液素［19-20］。研究發(fā)現(xiàn)MUC5AC在哮喘患者氣道內(nèi)的表達(dá)水平呈持續(xù)上升，是導(dǎo)致氣道黏液高分泌的主要因素［21］。在塵螨致敏的小鼠哮喘模型中，MUC5AC也有增加［22］。因此，抑制氣道黏液的高分泌及氣道重塑可能是哮喘治療的目標(biāo)。本研究結(jié)果顯示，哮喘狀態(tài)下小鼠的MUC5AC表達(dá)明顯增加，而血晶素治療后，MUC5AC的表達(dá)減少，提示血晶素能在一定程度上抑制MUC5AC，表明HO-1調(diào)控哮喘氣道炎癥與重塑的機(jī)制可能是通過(guò)抑制MUC5AC表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。

研究表明，通過(guò)刺激，氣道上皮釋放相應(yīng)的炎癥介質(zhì)、抗菌肽（如IL-25、IL-33、IL-13、IL-5、胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素等），參與氧化應(yīng)激、氣道高反應(yīng)、黏液高分泌和氣道重塑［23］。IL-25是IL-17細(xì)胞因子家族的成員，主要通過(guò)白細(xì)胞介素17B型受體（IL-17RB）發(fā)揮作用。IL-25參與包括哮喘在內(nèi)的多種氣道慢性炎癥疾病，可通過(guò)誘導(dǎo)氣道炎癥、氣道杯狀細(xì)胞變性、黏液高分泌、氣道高反應(yīng)性，從而進(jìn)一步促進(jìn)氣道重構(gòu)［24］。Gregory等［25］發(fā)現(xiàn)抗IL-25單克隆抗體可減輕塵螨誘發(fā)的哮喘性氣道炎癥反應(yīng)，減輕氣道重構(gòu)。本研究結(jié)果顯示，哮喘狀態(tài)下小鼠血清中IL-25的水平明顯升高，這與Zhang等［26］研究結(jié)果一致。而經(jīng)血晶素或福多司坦處理后，IL-25的表達(dá)減少，提示血晶素及福多司坦能在一定程度上抑制IL-25的表達(dá)，且血晶素較福多司坦作用明顯，表明HO-1可能通過(guò)抑制IL-25的表達(dá)，減輕哮喘氣道炎癥。筆者推測(cè)這種潛在的可能機(jī)制為：維持氣道對(duì)氧化應(yīng)激的不敏感性，減少炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)；HO-1抑制促炎因子的產(chǎn)生，從而防止觸發(fā)和放大炎癥效應(yīng)，減輕氣道炎癥。但本研究并未探討HO-1對(duì)哮喘小鼠氣道重構(gòu)改善的影響，有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，HO-1可降低MUC5AC及IL-25的表達(dá)，具有改善哮喘小鼠氣道炎癥反應(yīng)，減輕哮喘氣道黏液高分泌及炎癥損傷的作用，其作用機(jī)制可能與IL-25介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)信號(hào)通路密切相關(guān)，但具體機(jī)制尚未完全明確，還需要進(jìn)一步的深入研究。

（圖1、2見(jiàn)插頁(yè)）