劉偉，趙杰，宋廣平，劉偉，趙一賀，李代紅 （.天津市第一中心醫(yī)院輸血科， 天津 3009；.天津市第一中心醫(yī)院移植外科，天津 3009）

腎移植是目前終末期腎病患者最佳的腎臟替代治療方式，能夠提高患者的生活質(zhì)量和預(yù)期壽命?？贵w介導(dǎo)的排斥反應(yīng)（antibody-mediated rejection，AMR）是危害腎移植長(zhǎng)期預(yù)后的一個(gè)主要原因，也是導(dǎo)致移植腎加速失功的重要推動(dòng)因素。目前，抗體在實(shí)體器官移植排斥反應(yīng)中的作用研究主要集中在針對(duì)移植組織上的同種異基因靶器官的抗ABO血型和人類白細(xì)胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）特異性抗體上。有研究報(bào)道，MICA［1］、AT1R［2-4］、ETAR［5-6］和LG3［7］等非HLA 抗體會(huì)導(dǎo)致患者產(chǎn)生AMR。

天然抗體（natural antibodies，Nabs）主要結(jié)合一些氧化應(yīng)激下脂質(zhì)過氧化產(chǎn)生的氧化相關(guān)抗原，這些抗原包括自身抗原和外來抗原，也包括凋亡細(xì)胞的表面抗原。過氧化產(chǎn)生高活性產(chǎn)物，如丙二醛（malondialdehyde，MDA），與蛋白質(zhì)或脂質(zhì)共價(jià)結(jié)合形成了Nabs 識(shí)別的新表位［8］。在器官移植中，移植物的缺血/再灌注、移植物損傷、慢性排斥反應(yīng)等均有氧化應(yīng)激現(xiàn)象，使Nabs 結(jié)合到移植物中，最終造成移植物損傷。同時(shí)，Nabs 在維持體內(nèi)穩(wěn)定和免疫保護(hù)方面也具有重要作用，但在異體移植損傷中的作用機(jī)制仍不十分明確。本研究通過回顧性分析腎移植患者對(duì)MDA 有反應(yīng)的IgG Nabs 抗體的產(chǎn)生情況，從而探討其與移植物存活、腎組織活檢的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料：選取2015 年1 月— 2019 年6 月天津市第一中心醫(yī)院行同種異體腎移植術(shù)患者44 例，其中男性36 例，女性8 例，平均年齡為（45.8± 10.9）歲。入選標(biāo)準(zhǔn)：① 所有受者移植術(shù)前進(jìn)行補(bǔ)體依賴淋巴細(xì)胞毒試驗(yàn)結(jié)果為陰性； ② 術(shù)后均接受鈣調(diào)磷酸酶抑制劑（環(huán)孢素或他克莫司）為主的免疫抑制方案；③ 術(shù)后能夠定期隨訪，且各種資料完整；④ 所有患者均發(fā)生AMR。

1.2 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）檢測(cè)Nabs 抗體

1.2.1 血清IgG 的純化：根據(jù)試劑說明書，使用瓜子凝膠IgG 純化試劑盒（Thermo Science，Rockford，IL）純化患者血清標(biāo)本中的IgG。血清樣品使用緩沖液稀釋為1：10，與甜瓜凝膠孵育5 min，然后通過離心從凝膠中洗脫IgG。

1.2.2 MDA 反應(yīng)性評(píng)估：取1 mol/L 1，1，3，3-四甲氧基丙烷（湖北巨勝科技有限公司）2 ml 加入到8 ml 96 mmol/L HCl 中，37℃水解10 min，然后用1 mol/L NaOH 中和，調(diào)節(jié)pH 值到7.2 ～ 7.4。取10 ml MDA 與50 ml BSA （2 mg/ml） 溶液在37℃孵育3 h，然后4℃下用PBS 進(jìn)行廣泛透析72 h，得到MDA-BSA 包被抗原。然后，將高結(jié)合96 孔板包被 10 μg/ml MDA 修飾的BSA，4℃過夜。用添加0.5%水解酪蛋白的PBS 緩沖鹽水在室溫下封閉平板1 h。待檢血清用0.5%明膠的PBS 緩沖鹽水稀釋4 倍， 50 μl/孔加入到包被孔中，37℃作用30 min，250 μl/孔 清洗液洗板3 次，然后每孔加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的驢抗人IgG （上海生工生物有限公司）100 μl在37℃孵育30 min。使用3，3，5，5-四甲基聯(lián)苯胺底物顯色液進(jìn)行顯色15 min，最后加入終止液在450 nm 處測(cè)量OD 值。移植后Nabs（Nabs+）的產(chǎn)生被定義為移植后血清對(duì)MDA 的血清反應(yīng)性較移植前增加至少25%［9］。

1.3 Luminex 技術(shù)檢測(cè)抗HLA 抗體和抗供者特異性抗體：利用Luminex 液相芯片系統(tǒng)，采用LIFECODES LifeScreen Deluxe?PRA 和LIFE CODES LSA?Single Antigen（美國(guó)Immucor 公司）檢測(cè)腎移植術(shù)前和術(shù)后抗HLA 抗體和抗供者特異性抗體的水平。按照試劑盒操作說明書，應(yīng)用Luminex 讀取檢測(cè)結(jié)果，MATCH IT Antibody 軟件進(jìn)行分析。

1.4 AMR 的 診 斷：AMR 判 斷 依 據(jù)Banff 2013 標(biāo)準(zhǔn)和中國(guó)腎移植排斥反應(yīng)臨床診斷與治療指南 （2016 版）的臨床和病理結(jié)果［10］。腎臟組織學(xué)評(píng)價(jià)指標(biāo)包括：腎小球炎（g）、血管內(nèi)膜炎（v）、間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)（i）、小管炎（t）、管周毛細(xì)血管焱（ptc）、小動(dòng)脈玻璃樣變（ahh）、動(dòng)脈內(nèi)膜纖維化（cv）、間質(zhì)纖維化（ci）以及小管萎縮（ct）。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：應(yīng)用SPSS 20.0 版軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，計(jì)數(shù)資料以率表示。組間正態(tài)分布的計(jì)量資料采用t 檢驗(yàn)，組間計(jì)數(shù)資料均采用卡方檢驗(yàn)，影響受者存活時(shí)間的單因素分析采用Kaplan-Meier 回歸模型，P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.6 倫理學(xué)：本研究符合醫(yī)學(xué)倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)：得到倫理委員會(huì)審批（審批號(hào)：2019N164KY）。

2 結(jié) 果

2.1 腎移植術(shù)后患者一般資料分析（表1）：兩組腎臟移植受者在性別、年齡、術(shù)前并發(fā)癥、HLA錯(cuò)配數(shù)、DSA 產(chǎn)生情況、免疫抑制劑方案等方面的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。

表1 腎移植受者一般臨床資料

2.2 Nabs+組與Nabs-組移植腎存活率的比較 （圖1）：隨訪期間共有5 例腎移植受者出現(xiàn)移植腎功能喪失，其中Nabs+組3 例，Nabs-組2 例。Nabs+組移植術(shù)后移植物存活率明顯低于Nabs-組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.044）。

圖1 Nabs+組與Nabs-組移植腎存活率比較

2.3 Nabs 抗體與移植病理結(jié)果的比較：移植術(shù)后Nabs+的患者在腎小球炎癥（g）、間質(zhì)淋巴單核細(xì)胞侵潤(rùn)（i）、腎小管炎（t）和C4d 沉積的平均Banff評(píng)分都顯著升高，其中間質(zhì)淋巴單核細(xì)胞侵潤(rùn)（i）有顯著性差異（P=0.047，圖2D）。管周毛細(xì)管（ptc）（P=0.23，圖2B）、腎小球炎癥（g）（P=0.24，圖2C）、腎小管炎（t）（P=0.84，圖2E）和C4d沉積（P=0.59，圖2A）兩組間比較無顯著性差異。

2.4 兩組Nabs 與移植腎功能的關(guān)系：Nabs+組eGFR的均值為（19.0±4.0） ml/（min·1.73 m2）, Nabs- 組估算腎小球過濾率（estimated glomerular filtration rate，eGFR） 的 均 值 為（21.7±2.5） ml/（min·1.73 m2）， eGFR 測(cè)定的腎功能在Nabs+ 患者與Nab- 患者相比有所下降，但差異無顯著性 （P=0.64， 圖3）。

圖3 Nabs+組和Nabs-組eGFR 值的比較

3 討 論

在實(shí)體器官移植AMR 中，非HLA 抗體的作用日益被認(rèn)識(shí)到。以往的研究，Nabs 是與腎臟和心臟移植的不良結(jié)果相關(guān)的非HLA 抗體［11-12］。移植環(huán)境中自身抗體的產(chǎn)生取決于多種因素，通過缺血/再灌注、同種異體免疫和慢性炎癥介導(dǎo)的移植物損傷可導(dǎo)致凋亡細(xì)胞表面表達(dá)細(xì)胞內(nèi)蛋白，提高了這些細(xì)胞作為自身抗原的可能性。隨后，在細(xì)胞外小泡或第三級(jí)淋巴組織中，自身抗原可由受體或供體抗原提呈細(xì)胞呈遞給自身反應(yīng)性T 細(xì)胞和B 細(xì)胞，更好地理解自身抗體產(chǎn)生的機(jī)制可能導(dǎo)致識(shí)別新的治療策略，以預(yù)防或控制移植排斥反應(yīng)和異常血管重塑。目前對(duì)在移植過程中引發(fā)免疫反應(yīng)的自身抗原的不完全了解，從而阻礙了AMR 的診斷和治療。本研究探討了Nabs的發(fā)生與移植后的長(zhǎng)期結(jié)果和移植物損傷之間的關(guān)系，Nabs+組移植術(shù)后移植物存活率明顯低于Nabs-組。本研究與See 等［9］報(bào)道的結(jié)果相 一致。

由于入組的腎移植患者均發(fā)生了排斥反應(yīng)，本文進(jìn)一步研究了Nabs 與移植腎穿刺活檢和Banff評(píng)分之間的關(guān)系，結(jié)果顯示移植術(shù)后Nabs+的患者在腎小球炎癥（g）、間質(zhì)淋巴單核細(xì)胞侵潤(rùn)（i）、腎小管炎（t）和C4d 沉積的平均Banff 評(píng)分都顯著升高，其中間質(zhì)淋巴單核細(xì)胞侵潤(rùn)（i）有顯著性差異。

Nabs 的產(chǎn)生機(jī)制及其作用方式仍不明確。有研究報(bào)道，供體特異性抗體（donor specific antibody，DSA）介導(dǎo)的移植物損傷暴露內(nèi)皮細(xì)胞新表位，導(dǎo)致產(chǎn)生針對(duì)移植物的自身抗體［13］。然而，本文的研究結(jié)果表明，在沒有DSA 的情況下，Nabs 可以產(chǎn)生。此外，對(duì)小鼠的研究表明，缺 血/再灌注損傷暴露了導(dǎo)致組織破壞的隱蔽自身抗原［14］。人類移植腎的這種早期損傷可能會(huì)刺激內(nèi)皮脂質(zhì)過氧化，導(dǎo)致氧化特異性表位暴露和Nabs的產(chǎn)生。手術(shù)創(chuàng)傷引起的局部炎癥和移植物組織損傷，殘留的T 細(xì)胞同種異體反應(yīng)，甚至某些免疫抑制劑的腎毒性也可能觸發(fā)Nabs 的產(chǎn)生。此外，已知氧化特異性表位與細(xì)菌抗原（如肺炎鏈球菌的抗原)發(fā)生交叉反應(yīng)［15］。因此，接觸細(xì)菌也可能是Nabs 產(chǎn)生的潛在機(jī)制。

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，HLA 和非HLA 抗體都通過補(bǔ)體非依賴性的方式引起移植物損傷，包括抗體依賴的細(xì)胞毒性和內(nèi)皮細(xì)胞的激活［16-17］，Nabs 也可能以類似的方式激活移植物內(nèi)皮。已有報(bào)道研究，DSA 和AT1R 抗體這兩種抗體可能存在生物協(xié)同作用［18-19］。但由于本研究樣本量較少，沒有涉及Nabs 和DSA 之間的相加效應(yīng)，但在這兩種抗體的患者中觀察到的移植物存活率是顯著降 低的。

總體而言，本研究對(duì)發(fā)生排斥反應(yīng)的腎移植受者進(jìn)行的回顧性研究強(qiáng)調(diào)了Nabs 作為移植物丟失的獨(dú)立免疫危險(xiǎn)因素的相關(guān)性。Nabs 與移植后年組織損傷的組織學(xué)標(biāo)志物之間的關(guān)系也表明它們參與導(dǎo)致長(zhǎng)期移植失敗的移植物退化過程。下一步我們會(huì)增加樣本量作進(jìn)一步深入研究，從而指導(dǎo)臨床疾病狀態(tài)的分析及進(jìn)一步的免疫抑制治療，并制定策略，以改善長(zhǎng)期移植結(jié)果。