曲 良

（無錫輕工業(yè)大學(xué) 214036）

0 引言

與人體直接接觸的衣服和鞋子材料，由于存在有害物質(zhì)，可能會刺激皮膚或引起其他健康問題。由于用于紡織和皮革行業(yè)的某些化學(xué)藥品的已知毒性，因此其使用受到法律或其他法規(guī)的限制或禁止[1～4]。這種物質(zhì)之一是鉻（VI），可能是用于皮革鞣制或紡織品涂飾過程的化學(xué)物質(zhì)（重鉻酸鉀，鉻酸鉀，重鉻酸鈉和鉻酸鈉）的化合物。根據(jù)生態(tài)標(biāo)準(zhǔn)（EU Ecolabel 和Oekotex），最終產(chǎn)品中不應(yīng)存在該元素。皮膚接觸鉻化合物可導(dǎo)致敏感個體接觸性過敏性皮炎,具有很強(qiáng)的腐蝕性，并可能引起灼傷，從而促進(jìn)化合物的吸收并導(dǎo)致全身毒性。為了評估與化學(xué)風(fēng)險有關(guān)的紡織品安全性，必須進(jìn)行許多實驗室測試，以檢測不同的有害物質(zhì)V。這些方法耗時且價格昂貴，而且他們沒有告知被測物質(zhì)對人的有害影響[5～8]。確定生物測定在評估包含有害化學(xué)物質(zhì)的紡織品和皮革材料構(gòu)成的威脅中的有用性似乎是非常合理的，這是所描述研究的主要目的。為了實現(xiàn)研究目標(biāo)，確定了測試生物對鉻（VI）溶液的敏感性閾值。從紡織品和皮革樣品中提取已知鉻含量進(jìn)行生物危害測試驗證。

1 材料和方法

1.1 測試生物

梨狀四膜蟲是一種單細(xì)胞生物，由于它符合大多數(shù)測試生物的要求，并且是實驗室測試中常用的一種生物，因此被選為生物指示劑。梨形毛狀菌顯示出與人類細(xì)胞培養(yǎng)相似的敏感性，并允許對物質(zhì)和人類有機(jī)體的毒性做出有力的陳述。這是一種生物體，其細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)與細(xì)菌、酵母或藻類的細(xì)胞膜完全不同，從而形成了有毒化合物的屏障。此外，就生命功能，細(xì)胞結(jié)構(gòu)以及基因功能而言，四膜蟲細(xì)胞比其他模型微生物更接近人類細(xì)胞。

為了進(jìn)行毒理學(xué)測定，使用了來自英國Ambleside的藻類和原生動物的培養(yǎng)物保藏中心的菌株編號為CCAP 1630/1W 的四膜蟲四眼蟲（Ehrenberg）Wolff 1947。將培養(yǎng)物溫育48h，并處于“對數(shù)”階段，即在集約生長階段。

1.2 溶液和提取物的制備

為了評估紡織品和皮革材料的毒性，首先在1 至100mg/L 的重鉻酸鉀溶液中培養(yǎng)測試生物，然后將其重新計算為純鉻，然后在兩種材料的水提取物中以1.9 mg/l的濃度萃取1 號樣品中的Cr6+kg 和2 號樣品中的757mg/kg Cr6 +。由于2 號樣品的萃取物中鉻（VI）的含量非常高，用水將其稀釋至75%、50%和原始濃度的25%，這樣可以進(jìn)行更詳細(xì)的觀察。使用水作為提取劑是為了模擬濕物質(zhì)與人體皮膚的接觸。當(dāng)使用衣服或其他紡織品時，確實會偶爾或多或少地弄濕紡織品。

將純金屬離子溶液和材料提取物置于1.5mL 小杯中，然后加入懸浮在瓊脂中的受試微生物，從而獲得約5 000 個/mL 的細(xì)胞密度。將制備的樣品在28℃下孵育6 和24h，并直接測量溶液中細(xì)胞培養(yǎng)的光密度。為了觀察測試細(xì)胞增殖的變化，還使用了alamarBlue?細(xì)胞活力試劑，并且通過比色法測量570 nm 處的吸光度（使用600 nm 作為樣品）來記錄測試生物對樣品的鉻溶液和水提取物的反應(yīng)。

1.3 基于邏輯函數(shù)調(diào)節(jié)的毒性水平估算

為了評估鉻（VI）的毒性水平，用相對于梨形四膜蟲的半數(shù)抑制濃度（IC50）表示，通過比色法獲得的數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為能夠確定所研究物質(zhì)溶液相對于對照組的吸光度增加百分比抑制系數(shù)的形式。

2 結(jié)果和討論

2.1 評價生物指示劑對六價鉻溶液的敏感性閾值

在實驗的第一步，建立了梨形四膜蟲對鉻（VI）溶液的敏感性閾值。在重鉻酸鉀中孵育6 和24h 的測試生物溶液中alamarBlue?顏色變化的結(jié)果如圖1 所示。

組對照的紅色特征和重鉻酸鉀的濃度表明測試細(xì)胞的數(shù)量大且活力高，這完全降低了alamarBlue?細(xì)胞活力試劑。對于濃度較高的溶液（取決于孵育時間），可以觀察到紫色，因此得出結(jié)論，溶液中含有的活細(xì)胞數(shù)量比對照組少得多。在濃度為50 mg/L（孵育6h 后）或15 mg/L（孵育24h 后）的溶液中，藍(lán)色占主導(dǎo)地位。此顏色是alamarBlue?非還原形式的特征，表示缺少活細(xì)胞或代謝能力喪失。在比色法測量的基礎(chǔ)上肉眼可見的顏色變化，實驗數(shù)據(jù)見表1。在存在alamarBlue?細(xì)胞活力試劑的情況下根據(jù)比色法測量得出的結(jié)果差異不顯著(p<0.05)。

表1 溶液中鉻濃度對梨形四膜蟲增殖的影響

活力指數(shù)的值表示為表1 中處理過的和未處理的細(xì)胞之間的百分比差異，表明鉻濃度為1 mg/L 似乎對吡蟲無害。當(dāng)鉻對生物指示劑產(chǎn)生長期影響時，當(dāng)5 mg/L抑制細(xì)胞增殖至對照組的65.5%時。對細(xì)胞增殖的顯著負(fù)面影響顯示溶液濃度為15 mg/L。在該濃度下，增殖率僅達(dá)到組對照組的39.8%（孵育24h）。比色法測量溶液中較高的鉻濃度（高于50 mg/L）時顯示出非常低的吸光度值，因此活力指數(shù)值較低：該水平為對照組的30–51%。這些發(fā)現(xiàn)不僅可以證明對細(xì)胞增殖的抑制，還可以證明細(xì)胞的高死亡率。

表2 列出了近似函數(shù)的基本特征。

表2 重鉻酸鉀的邏輯參數(shù)

使用6h 的孵育時間，在20.8 至44.9Crmg/L 的濃度范圍內(nèi)記錄了對照組（IC50）在50%處的細(xì)胞增殖抑制作用，而在孵育24h 后，IC50 的濃度明顯降低，即介于4.69 和18.6mg/L 之間。這些結(jié)果表明六價鉻對四膜蟲的有害作用,在很大程度上取決于該元素在生物體上暴露的時間長度。即使在極低濃度的Cr（VI）溶液中，長時間暴露也會對生物指示劑產(chǎn)生強(qiáng)烈的負(fù)面影響。

2.2 紡織品和皮革材料毒性評估

在實驗的第二步，分析了紡織品和皮革材料的水提取物中梨形四膜蟲培養(yǎng)物生長的抑制率。肉眼觀察到的alamarBlue?細(xì)胞活力試劑的顏色變化觀察結(jié)果與預(yù)期結(jié)果一致，即：1 號樣品的提取物中出現(xiàn)紅色，表明受試生物的數(shù)量大，活力高，并且該樣品對生物指示劑沒有毒性作用；藍(lán)色的發(fā)生是由于在樣品2 號和它的解決方案（圖2）的提取物alamarBlue?試劑的不還原形式，證明關(guān)于活細(xì)胞此樣品的強(qiáng)有害影響。

3 結(jié)語

實驗結(jié)果表明，基于alamarBlue?分析法和梨形四膜蟲的生物指示性測量方法非常適用于篩選和評估紡織品和皮革材料中所含鉻（VI）的毒性。從1 號樣品（含量為1.9mg/kg Cr（VI）的紡織品樣品）中提取的提取物對受試生物具有較低的細(xì)胞毒性作用。相對于2 號樣品，觀察到了強(qiáng)烈的有害作用，這是由于該樣品中鉻含量高（757mg/kg）所致。值得注意的是，根據(jù)生物指示方法估算的樣品中鉻含量的值與使用分析方法獲得的相似（EN 71-3）。通過擬議的梨形四膜蟲作為生物指示劑的生物指示方法對紡織品提取物的毒性進(jìn)行的研究以及在目前的alamarBlue?細(xì)胞活力測定中進(jìn)行的比色測量證實了新發(fā)明的方法在紡織品安全性評估方面具有很高的效率化學(xué)風(fēng)險。