張露丹 ，王 金，張美英 ，劉 丹

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 301617；2.天津市武清區(qū)中醫(yī)醫(yī)院，天津 301700）

糖尿病周圍神經(jīng)病變（DPN）是糖尿病最常見的一種并發(fā)癥[1]。其臨床表現(xiàn)多種多樣，四肢對(duì)稱性疼痛、感覺異常、肢端麻木、針刺痛及灼熱感等為其主要的癥狀[2-3]。晚期則可能會(huì)出現(xiàn)如肌無力、肌萎縮、平衡受損等運(yùn)動(dòng)功能障礙的表現(xiàn)[4]。DPN亦是致使糖尿病足部潰瘍、壞疽及非創(chuàng)傷性下肢截肢的常見病因，并且持續(xù)性的慢性疼痛可使患者睡眠及生活質(zhì)量嚴(yán)重下降。研究顯示，隨著糖尿病的進(jìn)展，至少50%的患者會(huì)發(fā)展為DPN[5]，且多達(dá)50%的DPN患者沒有明顯的臨床癥狀[6]，因此對(duì)DPN的早期篩查和及時(shí)治療十分重要。

DPN的發(fā)生機(jī)制較為復(fù)雜，如氧化應(yīng)激、葡萄糖代謝異常、神經(jīng)營養(yǎng)改變等，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的治療方法包括控制血糖、改善微循環(huán)、抗氧化、營養(yǎng)及修復(fù)神經(jīng)等對(duì)癥治療[7]。中醫(yī)認(rèn)為本病的基本病機(jī)是氣陰兩虛、脈絡(luò)瘀阻，益氣活血通絡(luò)為其基本治法[8]。補(bǔ)陽還五湯出自清代王清任所著的《醫(yī)林改錯(cuò)》，是目前針對(duì)氣陰兩虛夾瘀型DPN使用最多的方劑。近年來，補(bǔ)陽還五湯治療DPN的研究也有較為全面的報(bào)道，臨床研究證實(shí)該方對(duì)治療DPN有確切療效[9-11]。筆者擬運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，對(duì)補(bǔ)陽還五湯治療DPN的分子機(jī)制進(jìn)行探討，為后期的深入研究提供方向。

1 方法

1.1 補(bǔ)陽還五湯活性成分的篩選及作用靶點(diǎn)的收集利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(tái)[12]（TCMSP）（http：//tcmspw.com/tcmsp.php），查找補(bǔ)陽還五湯中的黃芪、赤芍、川芎、當(dāng)歸、桃仁、紅花6味藥的化學(xué)成分，TCMSP數(shù)據(jù)庫未收錄地龍的化學(xué)成分，通過化學(xué)專業(yè)數(shù)據(jù)庫（http：//www.organchem.csdb.cn/scdb/default.asp）進(jìn)行補(bǔ)充檢索。以O(shè)B≥30%，DL≥0.18為條件對(duì)化學(xué)成分進(jìn)行篩選，得到中藥的活性成分，再利用TCMSP數(shù)據(jù)庫查找活性成分對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)，通過 UniProt數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org/）[13]查找靶蛋白的基因名，將其轉(zhuǎn)化為相對(duì)應(yīng)的基因簡稱。

1.2 DPN疾病靶點(diǎn)的獲取及補(bǔ)陽還五湯療DPN潛在作用靶點(diǎn)的預(yù)測 在 Drugbank（https：//www.drugbank.ca/）[14]、GeneCards 數(shù)據(jù)庫（https：//www.genecards.org/）[15]輸入疾病名稱“diabetic peripheral neuropathy”進(jìn)行檢索，將篩選結(jié)果合并，保留唯一值后獲得DPN疾病靶點(diǎn)集。并與上述補(bǔ)陽還五湯的作用靶點(diǎn)取交集，得到補(bǔ)陽還五湯治療DPN的潛在靶點(diǎn)。

1.3 關(guān)鍵作用靶點(diǎn)的篩選及蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將補(bǔ)陽還五湯治療DPN的潛在作用靶點(diǎn)導(dǎo)入 STRING 數(shù)據(jù)庫（http：//stringdb.org/），“Organism”選擇“Homo sapiens”，將置信度得分設(shè)置為“highest confidence（≥0.9）”，剔除孤立于網(wǎng)絡(luò)之外的靶點(diǎn)，得到核心靶點(diǎn)，將此作為補(bǔ)陽還五湯治療DPN的關(guān)鍵作用靶點(diǎn)。將獲取的蛋白相互作用關(guān)系，保存為TSV格式，保留文件中node1、node2及Combine score信息，并導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件，構(gòu)建 PPI網(wǎng)絡(luò)。再利用“Generate style from statistics”工具對(duì)網(wǎng)絡(luò)樣式進(jìn)行設(shè)置，其中，節(jié)點(diǎn)（node）的大小和漸變顏色反映Degree值的大小，邊（edge）的粗細(xì)反映蛋白之間相互作用的強(qiáng)弱。

1.4 “補(bǔ)陽還五湯-活性成分-關(guān)鍵作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 為了更直觀地顯示相互作用關(guān)系，將中藥、活性成分和關(guān)鍵作用靶點(diǎn)信息整理為Excel表上傳至Cytoscape3.7.2軟件，并構(gòu)建補(bǔ)陽還五湯-活性成分-關(guān)鍵作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，使得中藥、活性成分與靶點(diǎn)關(guān)系達(dá)到可視化，以探究補(bǔ)陽還五湯治療DPN的分子作用機(jī)制，并用于評(píng)價(jià)補(bǔ)陽還五湯中的活性成分及治療DPN的靶點(diǎn)的重要性。

1.5 GO富集分析和KEGG通路富集分析 使用R軟件對(duì)“1.3”得到的關(guān)鍵作用靶點(diǎn)進(jìn)行GO富集分析和KEGG通路富集分析，設(shè)定閾值P＜0.05為篩選標(biāo)準(zhǔn)，將結(jié)果以柱狀圖與氣泡圖的形式輸出。利用R軟件將所有關(guān)鍵作用靶點(diǎn)映射到KEGG數(shù)據(jù)庫的通路上，下載關(guān)鍵靶點(diǎn)所參與的通路圖進(jìn)行分析與研究。

1.6 “補(bǔ)陽還五湯-活性成分-靶點(diǎn)-KEGG通路”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將上述可能參與到DPN過程的前20條KEGG信號(hào)通路，與藥物、活性成分及參與調(diào)控的靶點(diǎn)一起整理為Excel表，上傳至Cytoscape 3.7.2軟件，構(gòu)建補(bǔ)陽還五湯-活性成分-靶點(diǎn)-KEGG通路網(wǎng)絡(luò)，再利用“Generate style from statistics”工具對(duì)網(wǎng)絡(luò)樣式進(jìn)行渲染，Degree值越高，相應(yīng)節(jié)點(diǎn)越大，在網(wǎng)絡(luò)中重要。

2 結(jié)果

2.1 補(bǔ)陽還五湯成分及作用靶點(diǎn)的收集 通過TCMSP、化學(xué)專業(yè)數(shù)據(jù)庫，查詢補(bǔ)陽還五湯7味藥的化學(xué)成分，去重后得到691個(gè)成分。其中，黃芪87個(gè)、赤芍75個(gè)、川芎189個(gè)、當(dāng)歸125個(gè)、桃仁66個(gè)、紅花189個(gè)、地龍35個(gè)。以O(shè)B≥30%及DL≥0.18作為潛在的活性成分篩選條件，共得到81個(gè)符合條件的化合物，其中黃芪17個(gè)、赤芍17個(gè)、川芎6個(gè)、當(dāng)歸2個(gè)、桃仁19個(gè)、紅花17個(gè)、地龍15個(gè)。將結(jié)果進(jìn)行OB值排序，川芎中的川芎哚（Perlolyrine）、楊梅酮（Myricanone），赤芍中的芍藥吉酮（paeoniflorgenone）、芍藥苷（paeoniflorin），紅花中的 6-羥基山奈酚（6-Hydroxykaempferol）、醌式紅花苷（qt_carthamone）、六羥黃酮（quercetagetin）、木酚素（lignan）、山柰酚（kaempferol），黃芪中的 7-O-甲基異微凸劍葉莎醇（7-O-methylisomucronulatol）、刺芒柄花素（formononetin），桃仁中的赤霉素A44（Gibberelln A44）等成分的OB值較高，表明這些成分的活性較高。再利用TCMSP數(shù)據(jù)庫依次查找81個(gè)活性成分的靶點(diǎn)，搜索的結(jié)果經(jīng)過篩選去重后共得到238個(gè)相應(yīng)作用靶點(diǎn)。

2.2 補(bǔ)陽還五湯療DPN潛在作用靶點(diǎn)的預(yù)測 通過Drugbank、GeneCards數(shù)據(jù)庫分別獲得 DPN疾病靶點(diǎn)10個(gè)、4 333個(gè)，合并去重后共獲得4 334個(gè)DPN疾病相關(guān)靶點(diǎn)。將補(bǔ)陽還五湯活性成分作用靶點(diǎn)與DPN疾病靶點(diǎn)相匹配，并通過Venny 2.1.0在線工具（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）繪制韋恩圖，得到補(bǔ)陽還五湯治療DPN的潛在靶點(diǎn)154個(gè)，見圖1，其中，黃芪 78個(gè)、當(dāng)歸34個(gè)、赤芍45個(gè)、川芎23個(gè)、桃仁 33個(gè)、紅花77個(gè)、地龍67個(gè)。再將以上7味藥治療疾病的靶點(diǎn)取交集，得到7味藥的共同靶點(diǎn)8個(gè)：PRSS1、ADH1C、NOS2、NOS3、ADRB2、PTGS2、F2、PTGS1，提示補(bǔ)陽還五湯可能通過上述共同靶點(diǎn)起到協(xié)同治療DPN的作用。

2.3 補(bǔ)陽還五湯治療DPN關(guān)鍵作用靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將補(bǔ)陽還五湯治療DPN的154個(gè)潛在作用靶點(diǎn)上傳至STRING數(shù)據(jù)庫，獲得滿足篩選條件的核心靶點(diǎn)124個(gè)，并將得到的蛋白相互作用信息輸入Cytocape軟件繪制PPI網(wǎng)絡(luò)，見圖2。圖中共有124個(gè)節(jié)點(diǎn)，329條邊，節(jié)點(diǎn)平均Degree為5.350，其中靶點(diǎn)蛋白 MAPK1、SRC、JUN、HSP90AA1、CTNNB1、VEGFA、TNF、TP53、ESR1、MAPK14、MAPK8、AGXT、APP、NR3C1、EGFR、IL6、F2的Degree值在平均Degree值的2倍以上，提示上述蛋白在PPI網(wǎng)絡(luò)中有重要作用。

2.4 “補(bǔ)陽還五湯-活性成分-關(guān)鍵作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)分析 利用Cytoscape軟件將7味中藥、活性成分及124個(gè)關(guān)鍵作用靶點(diǎn)構(gòu)建補(bǔ)陽還五湯-活性成分-關(guān)鍵作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，見圖3。整個(gè)網(wǎng)絡(luò)共204個(gè)節(jié)點(diǎn)，904條邊，其中橙紅色節(jié)點(diǎn)有7個(gè)，藍(lán)色節(jié)點(diǎn)有73個(gè)，黃色節(jié)點(diǎn)有124個(gè)，分別代表構(gòu)成補(bǔ)陽還五湯的藥物、活性成分及其關(guān)鍵作用靶點(diǎn)。并對(duì)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浞治?，?jié)點(diǎn)的平均Degree為8.863，大于平均Degree的節(jié)點(diǎn)有63個(gè)，以平均Degree值的2倍進(jìn)行核心節(jié)點(diǎn)的篩選，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，滿足條件的成分有：槲皮素、甘氨酸、山柰酚、木樨草素、β-谷甾醇、豆甾醇、異鼠李素、丙氨酸、7-O-甲基-異微凸劍葉莎醇、黃芩素、刺芒柄花素、常春藤皂苷元，故推測這12個(gè)成分是補(bǔ)陽還五湯治療DPN的主要活性成分。對(duì)網(wǎng)絡(luò)中的靶點(diǎn)根據(jù)Degree值進(jìn)行排序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，靶點(diǎn) PTGS2、ESR1、AR、NOS2、F2、PRSS1、CA2、PTGS1與成分連接次數(shù)達(dá)30次以上，對(duì)補(bǔ)陽還五湯治療DPN具有關(guān)鍵作用；而靶點(diǎn)NOS3、MAPK8、PPARG、HSP90AA1、GSK3B、MAPK14 與成分的連接次數(shù)在20次以上，在網(wǎng)絡(luò)中也可能起到重要作用。

2.5 GO富集分析及KEGG通路富集分析結(jié)果 GO富集分析中得到包括神經(jīng)遞質(zhì)代謝過程、對(duì)脂多糖的反應(yīng)、神經(jīng)遞質(zhì)水平的調(diào)節(jié)、對(duì)細(xì)菌源性分子的反應(yīng)、活性氧代謝過程、氧化應(yīng)激反應(yīng)、細(xì)胞對(duì)藥物的反應(yīng)、α-氨基酸代謝過程等生物過程（BP）3 814條；輔酶結(jié)合、維生素結(jié)合、內(nèi)肽酶活力、氨基酸結(jié)合、血紅素結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子活性等分子功能（MF）419條；膜區(qū)、囊腔、線粒體基質(zhì)、突觸后膜、胞質(zhì)囊腔、分泌顆粒內(nèi)腔等細(xì)胞組成（CC）293條，見圖4。

KEGG信號(hào)通路富集結(jié)果顯示，補(bǔ)陽還五湯治療DPN主要涉及的通路如下：AGE-RAGE信號(hào)通路、白細(xì)胞介素（IL）-17信號(hào)通路、腫瘤壞死因子（TNF）信號(hào)通路、松弛素信號(hào)通路、缺氧誘導(dǎo)因子（HIF）-1信號(hào)通路、前列腺癌、內(nèi)分泌抵抗等143條通路，見圖5。說明補(bǔ)陽還五湯活性成分的作用靶點(diǎn)散布在不同的通路途徑上，通過多途徑在DPN治療中發(fā)揮作用。

2.6 “補(bǔ)陽還五湯-活性成分-靶點(diǎn)-KEGG通路網(wǎng)絡(luò)”及部分通路展示 將“2.5”中得到的前20條KEGG信號(hào)通路，與參與調(diào)控的靶點(diǎn)、藥物及活性成分信息一起導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件，得到“補(bǔ)陽還五湯-活性成分-靶點(diǎn)-KEGG通路”的多維網(wǎng)絡(luò)，見圖6。結(jié)果顯示，圖中共有178個(gè)節(jié)點(diǎn)，851條邊，節(jié)點(diǎn)平均Degree為9.562，其中槲皮素（quercetin）的Degree值為 42，靶點(diǎn)蛋白 PTGS2、ESR1、AR、NOS2、NOS3、MAPK14、MAPK8、HSP90AA1、GSK3B、ESR2的Degree值在平均Degree值的2倍以上。將所有關(guān)鍵作用靶點(diǎn)映到KEGG數(shù)據(jù)庫中的相關(guān)通路上，得到143條通路圖，經(jīng)分析對(duì)比后，選擇如下通路圖進(jìn)行展示，見圖7，圖中紅色代表此研究中參與通路的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

3 討論

本次網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，在藥物活性成分的篩選中，有9種活性成分廣泛分布于補(bǔ)陽還五湯的多味藥物中，且已被證實(shí)有多種生物學(xué)效應(yīng)。例如，槲皮素存在于黃芪、紅花中，其可能通過Akt-mTOR途徑來增加高糖培養(yǎng)雪旺細(xì)胞的自噬，從而對(duì)DPN起到防治作用[16-17]；β-谷甾醇存在于紅花、桃仁、赤芍、當(dāng)歸中，其可通過提高脂肪組織中胰島素受體和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4的活性來調(diào)控血糖[18-19]；黃芩素、黃芩苷存在于紅花、赤芍中，其中黃芩素可通過抗氧化應(yīng)激反應(yīng)，抑制PKC、p38MAPK及多元醇通路的激活等途徑，起到延緩DPN發(fā)生的作用[20]。

在DPN的分子水平研究上，已有研究顯示，MAPK、SRC、TNF、IL-6 等與 DPN 的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[21-23]，但仍有部分靶點(diǎn)如 PTGS2、ESR1、AR、NOS2、F2 等在網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)聯(lián)性較高，在目前的研究中尚未進(jìn)行充分的證實(shí)，可為日后的研究提供新方向。

通過對(duì)補(bǔ)陽還五湯化合物-疾病靶點(diǎn)進(jìn)行GO及KEGG分析，發(fā)現(xiàn)補(bǔ)陽還五湯治療DPN主要涉及糖尿病并發(fā)癥AGE-RAGE信號(hào)通路、炎癥通路、癌癥通路、內(nèi)分泌抵抗通路等。

本研究發(fā)現(xiàn)B淋巴細(xì)胞瘤/白血病-2基因（BCL2）、IL-6、JUN、MAPK1、TNF 等 19 個(gè)基因主要富集于AGE-RAGE信號(hào)通路上，而AGE-RAGE信號(hào)通路在糖尿病周圍神經(jīng)病變中起重要作用。研究證實(shí)，晚期糖基化終末產(chǎn)物（AGEs）可在周圍神經(jīng)組織中積聚，與其受體相結(jié)合，激活NADPH氧化酶，進(jìn)而誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，通過啟動(dòng)下游關(guān)鍵細(xì)胞信號(hào)通路 p38（MAPK）途徑活化 NF-κB，進(jìn)一步激活白細(xì)胞介素IL-1、IL-6、TNF-α及VEGF的表達(dá)，促進(jìn)炎癥反應(yīng)，最終引起神經(jīng)細(xì)胞凋亡[24]。由此猜測，補(bǔ)陽還五湯可能通過調(diào)控AGE-RAGE信號(hào)通路中的上述相關(guān)蛋白來預(yù)防DPN發(fā)生。

IL-6、IL1B、TNF、CCL2、JUN、MAPK1 等 14 個(gè)基因主要富集在TNF信號(hào)通路。有研究表明，糖尿病神經(jīng)炎癥反應(yīng)可由NF-κB軸活化介導(dǎo)，NF-κB的衍生細(xì)胞因子TNF-α可誘導(dǎo)環(huán)氧合酶-2（COX-2）過度表達(dá)和絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）激活，進(jìn)一步觸發(fā)氧化應(yīng)激和過度炎癥反應(yīng)的發(fā)生[25]。而TNF-α、IL-1、IL-6 等可參與 DPN 的發(fā)病機(jī)制[26]。

EGFR、JUN、MAPK8、MMP1、NOS1、SRC 等 14 個(gè)基因主要富集于松弛素信號(hào)通路上，該通路是由松弛素家族多肽通過與4種松弛素家族多肽受體（RXFPs）結(jié)合后激活的復(fù)雜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，可發(fā)揮廣泛的生理作用[27]。包括抗纖維化、舒張血管、抑制氧化應(yīng)激、抗炎、治療心力衰竭、促進(jìn)傷口愈合等[28]。另外，研究提示，松弛素-2可增加糖代謝異常患者對(duì)外周胰島素的敏感性，其可能在某一程度上反映了胰島β細(xì)胞的代償能力和對(duì)葡萄糖的反應(yīng)能力[29]。為進(jìn)一步探索松弛素在抑制和阻斷糖尿病及其各種并發(fā)癥中起到的作用提供方向。

BCL2、EGF、EGFR、IL-6、NOS2、VEGFA 等 12 個(gè)基因主要富集于HIF-1信號(hào)通路，HIF-1α在糖尿病多種并發(fā)癥中的作用逐漸受到重視。實(shí)驗(yàn)證明，糖尿病小鼠HIF-1α是外周感覺神經(jīng)元中活性氧（ROS）的上游調(diào)控因子，HIF-1α信號(hào)的激活可抑制線粒體功能障礙、降低線粒體內(nèi)過多ROS的產(chǎn)生、并可誘導(dǎo)VEGF的表達(dá)，從而起到保護(hù)感覺神經(jīng)元的作用[30]。

綜上，DPN發(fā)病機(jī)制錯(cuò)綜復(fù)雜，運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對(duì)其物質(zhì)基礎(chǔ)及分子作用機(jī)制的研究，有助于預(yù)防及治療此病。結(jié)果提示，補(bǔ)陽還五湯治療疾病是通過多成分、多靶點(diǎn)、多通路的途徑來發(fā)揮療效，其可能通過參與抑制氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)等多種活動(dòng)發(fā)揮治療DPN的作用，為補(bǔ)陽還五湯治療DPN的基礎(chǔ)和臨床研究提供了新的方向。