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(1.山東省生態(tài)環(huán)境監(jiān)測中心,濟南 250014; 2.煙臺大學化學化工學院,煙臺 264005)

阿維菌素是一種通用的農(nóng)用或獸用殺菌、殺蟲、殺螨劑,也稱阿滅丁,是一種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素[1],在農(nóng)牧業(yè)生產(chǎn)中應用廣泛[2-3]。根據(jù)中國農(nóng)藥毒性分級標準,阿維菌素屬于高毒性化合物。很多國家規(guī)定了阿維菌素類藥物的最高殘留限量(MRLs),中華人民共和國農(nóng)業(yè)部公告第235號《動物性食品中獸藥最高殘留限量》中規(guī)定阿維菌素在牛、羊組織及奶中的最高殘留限量為20～100μg·kg-1,國家標準GB 2763-2019《食品安全國家標準食品中農(nóng)藥最大殘留限量》規(guī)定阿維菌素在黃瓜、柑、橘、梨中的最高殘留限量為20μg·kg-1。蔬菜、水果等生長與土壤密切相關(guān),因此測定土壤中阿維菌素是非常重要的。

目前,阿維菌素的測定方法主要有液相色譜法和高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)。液相色譜法采用紫外檢測器[4-5]時方法易受雜質(zhì)干擾,靈敏度較低;采用熒光檢測器時需要進行衍生化處理[6],操作比較復雜。高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法因選擇性好、定性及定量能力強,適用于阿維菌素的測定[7-8],但電噴霧離子源(ESI)軟電離技術(shù)會使其易形成[M＋Na]＋的穩(wěn)定離子結(jié)構(gòu),較難進行二級質(zhì)譜解離[1],同時[M＋Na]＋的響應易受介質(zhì)影響,重復測定時不穩(wěn)定且衰減快,不適合復雜樣品的測定[9]。目前,測定阿維菌素主要采用[M＋NH4]＋作為母離子[10-12],測定時一般[M＋Na]＋也同時存在,有時占比較大[1],造成靈敏度降低。本工作通過優(yōu)化色譜和質(zhì)譜條件,特別是通過優(yōu)化質(zhì)譜干燥氣溫度(去溶劑化溫度),消除了[M＋Na]＋的影響,最大化形成了[M＋NH4]＋,提高了方法的靈敏度,有利于阿維菌素的低含量測定。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 1260＋6460B QQQ型高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀,配ESI離子源;KQ-300TDE型超聲儀;Thermo scientific ST8型離心機;WHY-2型水浴恒溫振蕩器;Dionex SPE-280型固相萃取儀;Biotage型氮吹儀。

阿維菌素標準儲備溶液:100 mg·L-1,使用時用乙腈稀釋至所需質(zhì)量濃度。

磷酸鹽緩沖溶液:稱取4.8 g二水合磷酸二氫鈉用水溶解,加入磷酸2.5 mL,用水定容至250.0 mL。

乙腈為質(zhì)譜純;甲酸為質(zhì)譜專用;乙二胺四乙酸二鈉鹽、二水合磷酸二氫鈉、石英砂(二氧化硅)和乙酸銨均為分析純;磷酸為優(yōu)級純;試驗用水為超純水。

1.2 儀器工作條件

1) 色譜條件 Eclipse Plus C18色譜柱(3.0 mm×100 mm,1.8μm),柱溫35℃;ZORBAX SB-C18保護柱(4.6 mm×5 mm,1.8μm);進樣量5μL;流量0.3 mL·min-1;流動相:A為0.1%(體積分數(shù),下同)甲酸-5 mmol·L-1乙酸銨混合溶液,B為乙腈,A與B體積比為1∶9;等度淋洗10 min。

2)質(zhì)譜條件 ESI,正離子掃描模式;多反應監(jiān)測(MRM)模式對待測物進行定性和定量分析。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品采集

土壤樣品采集于濟南市某大片農(nóng)田,按照HJ/T 166-2004《土壤環(huán)境監(jiān)測技術(shù)規(guī)范》中的相關(guān)要求進行布點,用不銹鋼鏟子采集0～20 cm的表層土壤樣品,樣品集中混合,挑出樹枝、葉片、石子等雜物,取混合土壤1 kg,裝入潔凈的棕色磨口玻璃瓶中。共采集4個點位,樣品7 d內(nèi)分析完畢。

1.3.2 樣品前處理

稱取土壤樣品5.0 g置于離心管中,加入乙二胺四乙酸二鈉鹽0.5 g,加入pH 2.0的磷酸鹽緩沖溶液10 mL,加入乙腈10 mL,振蕩10 min,超聲提取10 min,以3 000 r·min-1轉(zhuǎn)速離心5 min,移取上清液,再重復提取2次,合并上清液,用水稀釋至200 mL,上固相萃取儀進行凈化濃縮。固相萃取時選用 Waters Qasis HLB SPE小柱(500 mg/6 mL),先用5 mL甲醇和5 mL水活化小柱,以10 mL·min-1的速率上樣,然后用5 mL水清洗HLB小柱,以氮氣為干燥氣,在350℃干燥30 min,再用6 mL甲醇分兩次進行洗脫。洗脫液用氮吹儀濃縮至近干,用乙腈定容至1.00 mL,經(jīng)0.22μm濾膜過濾,在儀器工作條件下進行測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

液相色譜流動相A為0.1%甲酸溶液、B為乙腈時,質(zhì)譜掃描發(fā)現(xiàn),阿維菌素僅能出現(xiàn)[M ＋Na]＋,未發(fā)現(xiàn)[M＋H]＋。產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因通常是由于化合物分子中含有易與Na＋結(jié)合的作用點位,常見的結(jié)合點位有羰基上的氧、醚鍵上的氧等,這也是質(zhì)譜圖解析的一個重要依據(jù),阿維菌素分子結(jié)構(gòu)中多達10個醚鍵,易與系統(tǒng)管路、樣品瓶、六通閥、噴霧針等介質(zhì)中殘留的微量Na＋形成穩(wěn)定的加合離子。試驗進一步發(fā)現(xiàn),[M＋Na]＋的響應并不穩(wěn)定,易受介質(zhì)中Na＋的影響;且利用[M＋Na]＋進行子離子模式掃描時,無論如何優(yōu)化碰撞能量和碎裂電壓,均難以解離出可穩(wěn)定利用的子離子,靈敏度較低,不適合將其作為母離子進行測定。但由于不同的質(zhì)譜儀性能可能存在稍許差異,且不同研究對靈敏度的要求不同,目前有少數(shù)文獻報道選用[M＋Na]＋作為母離子[13],多數(shù)研究都是采用[M＋NH4]＋作為母離子[8-12]進行阿維菌素的測定。本工作為了使母離子形成[M＋NH4]＋,選擇流動相A為0.1%甲酸-5 mmol·L-1乙酸銨混合溶液、B為乙腈,A與B的體積比為1∶9,等度淋洗10 min。

2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

一般情況下,流動相中加入乙酸銨后,應該出現(xiàn)[M＋NH4]＋形態(tài)的母離子,試驗發(fā)現(xiàn),當干燥氣(氮氣)溫度為350 ℃時,[M＋NH4]＋占比仍非常小,幾乎可以忽略,占比較大的仍是[M＋Na]＋,所以需要對質(zhì)譜參數(shù)進行進一步優(yōu)化以形成[M＋NH4]＋。首先優(yōu)化碰撞能量和碎裂電壓,但效果不明顯,后經(jīng)多次試驗發(fā)現(xiàn),質(zhì)譜干燥氣溫度對阿維菌素離子加合物的形態(tài)和豐度都有很大影響。而本試驗最初干燥氣溫度之所以使用350 ℃,原因主要有HPLC-MS/MS測定有機物時,多數(shù)化合物在質(zhì)譜中易形成[M＋H]＋,較易進一步解離[14],干燥氣溫度對測定影響不大,而且儀器的復雜性常使分析人員難以全面考慮所有參數(shù)的優(yōu)化,所以多數(shù)研究一般使用默認干燥氣溫度(試驗開始時儀器默認干燥氣溫度為350℃,該溫度下測定磺胺類、喹諾酮類等抗生素時質(zhì)譜響應良好)。為進一步研究干燥氣溫度對阿維菌素加合離子的影響,試驗考察了干燥氣溫度為150,200,250,300,350 ℃時對[M＋Na]＋、[M＋NH4]＋和[M＋H]＋等加合離子的影響,結(jié)果見圖1。

圖1 質(zhì)譜干燥氣溫度對阿維菌素加合離子的影響Fig.1 Effect of mass gas temperature on the adduct ions of avermectin

由圖1可知:當干燥氣溫度為150,200 ℃時,[M＋NH4]＋占比為100%,且200 ℃時其峰面積響應最大;當干燥氣溫度為250,300,350 ℃時,[M＋Na]＋占比開始逐漸升高,[M＋NH4]＋占比逐漸降低,且總響應值不斷降低;不同溫度下,[M＋H]＋占比均很低。為更直觀地說明200,350 ℃時,[M＋Na]＋、[M＋NH4]＋、[M＋H]＋等3種離子的響應情況,阿維菌素在200 ℃和350 ℃溫度下的選擇離子(SIM)譜圖見圖2。

由圖2可知:目標物在5.1 min左右出峰,200 ℃時[M＋NH4]＋響應高,[M＋Na]＋無響應,且基線不穩(wěn)定(受介質(zhì)中殘留Na＋離子的影響),[M＋H]＋無響應;350 ℃時[M＋Na]＋響應高,[M＋NH4]＋響應極低,且基線不穩(wěn)定(受流動相中NH4＋的影響),[M＋H]＋響應低;同時,200 ℃時[M＋NH4]＋的強度約是350 ℃時[M＋Na]＋的7倍,靈敏度高。綜合上述因素,試驗選擇質(zhì)譜干燥氣溫度為200 ℃。

圖2 200 ℃和350 ℃下阿維菌素等3種加合離子的SIM譜圖Fig.2 SIM chromatograms of three adduct ions of avermectin at 200 ℃and 350 ℃

如果不對干燥氣溫度進行優(yōu)化,僅在[M ＋Na]＋和[M＋NH4]＋同時存在時選擇[M＋NH4]＋作為母離子進行二級質(zhì)譜測定,必定會導致靈敏度的下降。同時也說明,由于干燥氣溫度與流動相的有效去溶劑化和離子的形成密切相關(guān),對于其他多羰基、多醚鍵、易形成[M＋Na]＋而難以進行二級質(zhì)譜測定的化合物,測定時可以對干燥氣溫度進行優(yōu)化,以形成易解離的母離子,本方法為該類化合物的類似測定問題提供了很好的解決思路。

干燥氣溫度設定為200 ℃時,對質(zhì)譜的碎裂電壓和碰撞能量進行了優(yōu)化,測定阿維菌素的最佳質(zhì)譜參數(shù)見表1,其中“*”為定量離子。阿維菌素MRM提取離子色譜圖見圖3。

表1 質(zhì)譜參數(shù)Tab.1 MS parameters

2.3 標準曲線和檢出限

按試驗方法對5.0,10,20,50,100μg·L-1阿維菌素標準溶液系列進行測定,以阿維菌素的質(zhì)量濃度為橫坐標,以定量離子的峰面積為縱坐標繪制標準曲線。結(jié)果表明:阿維菌素的質(zhì)量濃度在5.0～100μg·L-1內(nèi)與其峰面積呈線性關(guān)系,其線性回歸方程為y＝132.3x＋66.84,相關(guān)系數(shù)為0.999 0。

圖3 阿維菌素的MRM譜圖Fig.3 MRM chromatogram of avermectin

檢出限參照HJ 168-2010《環(huán)境監(jiān)測分析方法標準制修訂技術(shù)導則》的相關(guān)規(guī)定,連續(xù)分析7個接近于檢出限濃度的實驗室空白加標樣品(以硅藻土或石英砂為實驗室空白),計算標準偏差(s)。用公式MDL＝s×t(n-1,0.99)計算檢出限,其中,t(n-1,0.99)為置信度,置信度為99%、自由度為n-1時的t值,n為重復分析的樣品數(shù),若連續(xù)分析7個樣品,t(6,0.99)＝3.143。方法的檢出限(3.143s)為0.24 ng·g-1。

2.4 精密度和回收試驗

在5.0 g空白土壤樣品中加入50 ng阿維菌素,做6個平行樣,樣品經(jīng)前處理后在儀器工作條件下進行測定,計算回收率和測定值的相對標準偏差(RSD),結(jié)果見表2。

表2 精密度和回收試驗結(jié)果(n＝6)Tab.2 Results of tests for precision and recovery(n＝6)

2.5 樣品分析

按試驗方法對采自濟南某農(nóng)田的土壤樣品中阿維菌素進行測定,同時利用加標回收進行質(zhì)量控制,結(jié)果表明,實際土壤樣品未檢出阿維菌素。

本工作通過優(yōu)化干燥氣溫度,建立了測定土壤中阿維菌素的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法,該方法穩(wěn)定、可靠、靈敏,可滿足實際樣品的測定,同時為其他因易形成[M＋Na]＋而難以進行二級質(zhì)譜測定的類似化合物提供了很好的解決思路。