曲 瑤 張亞旗 肖 光 楊 成

(大連理工大學化工學院化學系， 精細化工國家重點實驗室, 大連 116024)

1 引 言

赭曲霉毒素A(OTA)是由青霉菌屬和曲霉菌屬次級代謝產(chǎn)生的一種霉菌毒素，廣泛存在于谷物、咖啡、可可、葡萄酒及果汁等食品中。OTA具有腎毒性、肝毒性、可導致DNA損傷以及抑制RNA和蛋白質(zhì)合成等危害，具有致畸、致癌、致突變作用[1]。國際癌癥研究機構(gòu)(IARC)將OTA列為2B類致癌物質(zhì)，已有100多個國家對食品和動物飼料中OTA作出了限量規(guī)定，我國國標GB2761-2017[2]規(guī)定，谷物及其研磨加工品、豆類及其制品、堅果及籽類、烘焙咖啡豆中不得超過5 μg/kg，速溶咖啡中不超過10 μg/kg， 而葡萄酒中不超過2 μg/kg。由于OTA毒性高、分布廣、危害大，因此建立簡單、快速、低成本、高靈敏的檢測方法是實現(xiàn)OTA監(jiān)管的有效手段。在OTA的檢測方法中，高效液相色譜-熒光/質(zhì)譜檢測方法，具有靈敏度高、重現(xiàn)性好的特點，是國家標準建議的方法，但對實驗人員的操作技能和儀器設(shè)備要求較高，且檢測成本較高，無法滿足現(xiàn)場快速檢測的要求[3,4]。酶聯(lián)免疫方法[5]因其檢測通量高、檢測速度快，被廣泛應(yīng)用于OTA的檢測，但在實際操作過程中，需要使用有毒標準樣品，對檢測人員及環(huán)境存在潛在危害。免疫試紙條也被廣泛應(yīng)用于現(xiàn)場快速檢測[6]，但由于OTA是有毒小分子(MW=403.8)，免疫原性低、抗體研制難度大，限制了免疫試紙條的發(fā)展。

近年出現(xiàn)的核酸適配體傳感方法為OTA快速檢測提供了新的解決方案。核酸適配體是通過指數(shù)富集配體系統(tǒng)進化技術(shù)(SELEX)在體外篩選出來的能夠特異性結(jié)合目標配體的寡聚核苷酸片段[7]。核酸適配體有可化學合成、穩(wěn)定性好、易修飾、靶分子范圍廣等優(yōu)點，基于核酸適配體的生物傳感器成為近年來的研究熱點[8,9]?；诤怂徇m配體用于OTA檢測的傳感器有比色型[10]、熒光型[11]、電化學型[12]和化學發(fā)光型[13,14]等。相較于免疫型傳感器，核酸適配體傳感器具有以下優(yōu)點：首先，核酸適配體與OTA結(jié)合前后，核酸適配體的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生了顯著的變化，這為以空間結(jié)構(gòu)變化為傳感響應(yīng)的傳感器設(shè)計提供了可能; 其次，核酸適配體的互補寡聚核酸探針短鏈是靶標分子的天然競爭物，可避免使用有毒OTA標記物為競爭物，環(huán)境友好。

熒光生物傳感器依賴于熒光信號的變化，如熒光增強、熒光猝滅、熒光偏振等實現(xiàn)目標物的檢測。SYBR Green I (SGI)是常見的非標記熒光染料，與雙鏈DNA結(jié)合后，熒光信號可增強800～1000倍，且與雙鏈DNA的量正相關(guān)。由于SGI沒有選擇性，與雙鏈DNA結(jié)合使得檢測背景信號較高[15]。偏振熒光的強弱程度與熒光團所連接的分子大小呈正相關(guān)，與其受激發(fā)時轉(zhuǎn)動的速度呈負相關(guān)， 所以熒光偏振技術(shù)也常用于檢測小分子的核酸適配體生物傳感器[16,17]。偏振熒光的檢測對于儀器設(shè)備的要求比較高，更適用于實驗室的科學研究。熒光猝滅是常用的熒光傳感模式，從猝滅機理上可分為靜態(tài)猝滅和動態(tài)猝滅。靜態(tài)猝滅是猝滅劑與基態(tài)熒光團形成配合物，導致的熒光猝滅。動態(tài)猝滅是猝滅劑影響熒光團的激發(fā)態(tài)，包括共振能量轉(zhuǎn)移和光誘導電子轉(zhuǎn)移(PET)?；诤怂岬墓舱衲芰哭D(zhuǎn)移，需共價連接有機熒光猝滅團，常見的熒光淬滅基團如BHQ(Black hole quencher)，其猝滅效率高，但是修飾成本較高。最近的研究發(fā)現(xiàn)，納米金球[18]、碳納米管[19]、石墨烯[20]和MoS2[21]等納米材料可通過非特異性吸附，基于PET機理猝滅標記在核酸上的熒光團。以納米材料為猝滅劑可大大降低使用成本，但由于是非特異性吸附，所以選擇性較差。

鳥嘌呤是具有多個給電子基團的稠雜環(huán)化合物，電子密度較大，可作為電子供體。研究表明，鳥嘌呤在核酸的5種堿基中氧化電位最低[22]，具有較高的HOMO (Highest occupied molecular orbital, 最高占據(jù)分子軌道)能級，最易被氧化。當熒光團被激發(fā)，熒光團的電子被激發(fā)到LUMO (Lowest unoccupied molecular orbital，最低未占分子軌道) 能級，鳥嘌呤的電子可通過電子轉(zhuǎn)移到熒光團的HOMO軌道上，使處于激發(fā)態(tài)的熒光基團電子無法恢復(fù)到基態(tài)，導致熒光猝滅，即鳥嘌呤通過PET機理實現(xiàn)對熒光基團的猝滅[23-25]。熒光基團可修飾在寡聚核酸探針短鏈上，因此可以提高系統(tǒng)的選擇性。Xiang[26]等報道了一種基于鳥嘌呤可猝滅FAM和TAMRA(5-羧基四甲基羅丹明)的熒光方法，通過同步熒光法，實現(xiàn)兩組單核苷酸多態(tài)性(SNP)同時分析。基于堿基猝滅熒光策略構(gòu)建傳感器，避免了標記猝滅基團，檢測過程簡單，選擇性好，檢測成本低。

OTA的核酸適配體富含鳥嘌呤，是理想的FAM猝滅序列?；邙B嘌呤可通過PET過程猝滅FAM的熒光，本研究構(gòu)建了OTA的核酸適配體傳感器。當體系中不存在OTA時，修飾有FAM的寡聚核酸探針短鏈與OTA核酸適配體雜交，F(xiàn)AM靠近鳥嘌呤，發(fā)生PET過程使得熒光被猝滅。而當OTA存在時，OTA與核酸適配體結(jié)合，且誘導其形成剛性的反平行G-四鏈體結(jié)構(gòu)[27]，抑制了FAM修飾探針DNA與OTA核酸適配體雜交，因此FAM得以發(fā)射熒光。通過測定體系熒光強度恢復(fù)率，實現(xiàn)對OTA的檢測。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

PTC-150 PCR擴增儀(美國 MJ. Research. INC); XH-C漩渦混合器(金壇市白塔新寶儀器廠); XK96-3微量振蕩器(江蘇新康醫(yī)療器械有限公司); D1008E低速小型離心機(江蘇新康醫(yī)療器械有限公司)、ReadMax 1900光吸收型全波長酶標儀(上海閃譜生物科技有限公司); Infinite 200Pro 多功能酶標儀(瑞士Tecan 公司); FE-20 pH計(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司); Mili-Q超純水系統(tǒng)(美國 Milipore公司); WHB-96-02 96孔全黑微孔板(上海臥宏生物科技有限公司)。

NaCl、MgCl2、CaCl2和NaOH(分析純，國藥集團化學試劑有限公司); 三羥甲基氨基甲烷(Tris，純度>99.0%，BBI Life Sciences); OTA、赭曲霉素B(OTB)、Warfarin(分析純 Sigma-Aldrich公司)。實驗用水為超純水。紅葡萄酒購于本地超市。核酸適配體和熒光標記寡聚核酸探針序列(FAM-DNA)購自生工生物工程(上海)股份有限公司，序列見表1，用超純水配制成100 μmol/L母液。

2.2 Ga2+濃度優(yōu)化

檢測液為10 mmol/L Tris-HCl緩沖溶液(pH 8.4)，含20 nmol/L 核酸適配體、120 mmol/L NaCl。將檢測液分為不加OTA和加入100 nmol/L OTA兩組。 將兩組溶液分別加入到96孔全黑微孔板中，在微孔中分別加入不同濃度的CaCl2孵育15 min; 各孔中加入10 μL 200 nmol/L FAM-DNA溶液，混合均勻，常溫孵育5 min。使用Infinite 200Pro多功能酶標儀記錄熒光響應(yīng)值，激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長525 nm。

2.3 OTA的定量檢測

基于鳥嘌呤猝滅單標記FAM的OTA熒光檢測過程如下：核酸適配體用超純水配制成100 μmol/L母液，母液加熱到95℃，保持5 min，然后快速降溫到4℃，保持2.5 min，備用。用100 mmol/L Tris-HCl緩沖溶液(pH 8.4)配制含有200 nmol/L 核酸適配體、1.2 mol/L NaCl、100 mmol/L CaCl2的檢測液。將待測樣品80 μL加入到96孔全黑微孔板中的孔中，再加入10 μL檢測液，混勻，反應(yīng)15 min; 各孔中加入10 μL 200 nmol/L FAM-DNA溶液，定溫孵育5 min。使用Infinite 200Pro多功能酶標儀(激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長525 nm)記錄熒光響應(yīng)值。定義熒光恢復(fù)率R(%)=(Fx-F0)/F0×100%，其中，F(xiàn)x是樣品的熒光強度，F(xiàn)0是空白樣品的熒光強度。本研究中所有實驗均平行測試5次。

2.4 實際紅葡萄酒樣品分析

根據(jù)OTA的物理化學性質(zhì)，采用文獻[28]中雙液液萃取方案并稍作改進進行紅葡萄酒的前處理。取10 mL紅酒樣品，加入等體積的甲苯，混合均勻，離心分層。取頂層有機相，加入等體積的Tris-HCl緩沖溶液(pH 8.4)，混合均勻，離心分層。抽取底層水相，調(diào)至pH 3.0，加入等體積的二氯甲烷,均勻混合，離心分層。抽取底層有機相，加入等體積的Tris-HCl緩沖溶液(pH 8.4)，混合均勻，離心分層。從頂層水相中抽取萃取后不含有紅酒基質(zhì)的待測液,用于后續(xù)的分析檢測。

標準添加實驗中，分別取10 mL紅酒樣品，加入甲醇稀釋的10mol/L OTA標準溶液 1、2、4和8L(OTA終濃度分別為1、2、4和8 nmol/L)，混勻，按照上述樣品處理方法制備待測樣品，并進行檢測，計算回收率。

3 結(jié)果與討論

3.1 實驗原理

本研究構(gòu)建了一種基于鳥嘌呤猝滅FAM單標記的熒光核酸適配體傳感器，用于檢測OTA，檢測原理如圖1所示。根據(jù)PET機理，鳥嘌呤可猝滅FAM的熒光，OTA的核酸適配體富含鳥嘌呤，是比較理想的FAM猝滅序列。體系中沒有OTA時，F(xiàn)AM-DNA探針與核酸適配體雜交，F(xiàn)AM由于靠近鳥嘌呤發(fā)生PET，熒光被猝滅。隨著OTA的加入，OTA與核酸適配體特異性結(jié)合，OTA誘導核酸適配體形成剛性的反平行G四鏈體結(jié)構(gòu)[27]，抑制了FAM-DNA與核酸適配體的雜交，F(xiàn)AM遠離鳥嘌呤，抑制PET過程，所以FAM的熒光強度逐漸恢復(fù)，通過FAM熒光強度的恢復(fù)率實現(xiàn)對OTA的測定。

3.2 Ca2+濃度的選擇

二價陽離子，如Ca2+或Mg2+，對于核酸適配體識別OTA具有至關(guān)重要的作用[17]，特別是Ca2+的影響較大。不同濃度Ca2+對檢測結(jié)果的影響如圖2A所示。OTA不存在時，由于核酸的磷酸骨架帶有大量的負電荷，溶液中的核酸鏈互相排斥。陽離子有屏蔽電荷的作用，特別是二價陽離子的屏蔽作用更強，因此，隨著Ca2+濃度增加，核酸適配體與FAM-DNA的雜交效率提高，F(xiàn)AM靠近互補鏈上的鳥嘌呤，發(fā)生PET，F(xiàn)AM的熒光被鳥嘌呤猝滅。OTA存在時，由于Ca2+促進OTA誘導核酸適配體形成反平行G-四鏈體結(jié)構(gòu)，抑制核酸適配體與FAM-DNA探針的雜交。而不存在Ca2+時，核酸適配體不能識別OTA。當Ca2+濃度低于5 mmol/L時，隨著Ca2+濃度增加，熒光信號增強，也進一步證明Ca2+對于核酸適配體識別OTA的作用。加入不同濃度Ca2+時的熒光恢復(fù)率如圖2B所示，Ca2+濃度在6.0～25 mmol/L范圍內(nèi)的熒光恢復(fù)率較高。在后續(xù)實驗中加入10 mmol/L Ca2+。

圖2 (A)不同濃度Ca2+存在時檢測的熒光響應(yīng)值; (B)不同濃度Ca2+存在時的熒光恢復(fù)率Fig.2 (A) Fluorescence intensity with different concentrations of Ca2+ in the absence and presence of OTA; (B) FL recovery rates with different concentrations of Ca2+

3.3 單標記熒光核酸探針的優(yōu)化

圖3 (A)OTA適配體加入不同F(xiàn)AM-DNA鏈時，在不同OTA濃度下的熒光強度恢復(fù)率; (B)OTA適配體加入不同F(xiàn)AM-DNA鏈時的R(IC50)/IC50值Fig.3 (A) Recovery rate with different concentrations of OTA under the condition of aptamer of OTA binding with 6 different FAM-DNA sequences; (B) Value of R(IC50)/IC50 with different FAM-DNA sequences

本傳感器中，F(xiàn)AM-DNA和OTA競爭與核酸適配體進行雜交，其中鳥嘌呤堿基和熒光團之間的相對位置、FAM-DNA的堿基數(shù)會影響兩者之間的親和性及猝滅效率，進而影響OTA的檢測。考察了鳥嘌呤和FAM的相對位置對傳感器的影響，共設(shè)計了6條FAM-DNA探針，如表1所示。其中FP4-12、FP5-13、FP6-14、FP7-15與核酸適配體有9個互補的堿基。FP5-13與適配體結(jié)合后，F(xiàn)AM與T-14堿基靠近，并未出現(xiàn)熒光猝滅，表明僅有核酸鏈雜交，F(xiàn)AM并未靠近未雜交鳥嘌呤，不發(fā)生熒光猝滅; 而其它3條FAM-DNA均表現(xiàn)出不同程度的熒光猝滅現(xiàn)象，其中FP4-12的響應(yīng)效果最好。進一步考察了FAM-DNA堿基數(shù)對傳感器的影響， FP2-12與核酸適配體有11個互補堿基， FP2-11與核酸適配體有10個互補堿基。不同OTA濃度下使用不同F(xiàn)AM-DNA獲得的熒光強度恢復(fù)率如圖3A所示。為評價傳感器的綜合性能，以R(IC50)/IC50為傳感器的靈敏度，其中，IC50為OTA的半抑制濃度，R(IC50)為IC50時的熒光強度恢復(fù)率。圖3B為采用不同F(xiàn)AM-DNA傳感器的靈敏度R(IC50)/IC50，其中以FP2-11為FAM-DNA傳感器靈敏度最高，而FP2-12與FP4-12的靈敏度相近，但遠低于FP2-11。

3.4 選擇性

圖4 熒光強度恢復(fù)率隨OTA、OTB、Warfarin濃度變化曲線Fig.4 FL recovery rate of different concentrations of OTA, OTB and Warfarin

考察了OTB和Warfarin對檢測OTA的干擾情況。OTB在分子結(jié)構(gòu)上僅比OTA少一個氯原子，單克隆抗體對OTA的響應(yīng)僅是OTB的3倍，多克隆抗體對于OTA、OTB的識別差別僅為20%[29]; Warfarin的分子結(jié)構(gòu)與OTA的相似，在免疫傳感器中常被用作干擾分子。如圖4所示，OTA的熒光強度恢復(fù)率明顯高于OTB和Warfarin，表明本方法選擇性良好。

3.5 核酸適配體傳感器檢測OTA

在最佳條件下(10 mmol/L Ca2+、20 nmol/L Ap-OTA、20 nmol/L FP2-11、10 mmol/L Tris-HCl緩沖溶液、pH=8.4)考察了OTA濃度與熒光強度恢復(fù)率之間的關(guān)系。如圖5所示，OTA濃度在0.67～7.80 nmol/L范圍內(nèi)與熒光強度恢復(fù)率呈良好線性關(guān)系，校正曲線方程為R(%)=-0.02+1.76COTA(nmol/L)(R2=0.9996，n=5)，檢出限為0.67 nmol/L (S/N=3)。按照2.4節(jié)中前處理方法處理紅葡萄酒樣品，利用本方法檢測紅葡萄酒中OTA, 檢出限為0.27 μg/kg。

圖5 (A) 熒光強度恢復(fù)率隨OTA濃度變化曲線; (B) OTA濃度與熒光強度恢復(fù)率之間線性曲線Fig.5 (A) FL recovery rate versus different concentrations of OTA; (B) Linear curve of concentration of OTA and FL recovery rate

與基于不同猝滅劑檢測OTA的分析方法相比(表2)，以納米金、單壁碳納米管、氧化石墨烯、MoS2等納米材料為猝滅劑比鳥嘌呤的猝滅效率更高，但是由于納米材料與核酸適配體是非特異性的相互作用，導致這些方法的檢出限較高。而本方法以鳥嘌呤為FAM猝滅劑，熒光標記的寡聚核酸探針與核酸適配體特異性識別，F(xiàn)AM被選擇性猝滅。因此，本方法選擇性更好，檢出限更低。

表2 基于不同猝滅劑的分析方法檢測OTA的性能比較

3.6 紅葡萄酒酒樣品中OTA的檢測

將市售紅葡萄酒按照2.4節(jié)的方法進行前處理，采用本方法進行測定(見表3), 紅葡萄酒中未檢出OTA，4個加標水平下OTA的加標回收率為92.4%～100.9%，表明本方法準確性良好，可用于紅葡萄酒中OTA的檢測。

表3 紅葡萄酒中OTA加標回收實驗結(jié)果 (n=5)

4 結(jié) 論

以鳥嘌呤為猝滅劑，基于PET機理猝滅熒光素的熒光， 構(gòu)建了基于鳥嘌呤猝滅單標記熒光的OTA核酸適配體傳感器。本傳感器的線性檢測范圍為0.67～7.80 nmol/L，檢出限為0.67 nmol/L (S/N=3)，對應(yīng)于紅葡萄酒中的檢出限為0.27 μg/kg，可以滿足國標對紅葡萄酒中OTA的最高限量(2 μg/kg)的檢測要求。相較于以納米材料為猝滅劑的傳感方法，本方法的檢出限更低，并具有操作簡單快速、靈敏度高、選擇性好、成本低等優(yōu)點。