楊 丹，姜 嵐，黃 娟，陳曉莉，楊嬌娜

（1.玉溪師范學(xué)院 化學(xué)生物與環(huán)境學(xué)院，云南 玉溪 653100；2.昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 超聲科/云南省超聲診斷質(zhì)量控制中心/云南省超聲影像研究中心，云南 昆明 650032）

前 言

三七皂苷R1 來源于中藥三七（Panaxnotoginseng）的干燥根及根莖，研究顯示其內(nèi)的有效成分三七皂苷R1 對(duì)急性心梗的大鼠心肌具有保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能與減少心肌酶釋放以及抑制心肌細(xì)胞凋亡有關(guān)[1]。但是生物體對(duì)藥物的吸收、代謝、排泄是一個(gè)極其復(fù)雜的過程，中藥產(chǎn)生的藥理效應(yīng)不能唯一的歸功于該藥物的化學(xué)組成成分，還應(yīng)與藥物的物理狀態(tài)等密切相關(guān)。納米中藥是指運(yùn)用納米技術(shù)制造的中藥有效成分、原藥及其復(fù)方制劑[2]。PLGA 是一種可降解的功能高分子有機(jī)化合物，具有良好的生物相容性、無毒、良好的成囊和成膜的性能，被廣泛應(yīng)用于制藥、醫(yī)用工程材料和現(xiàn)代化工業(yè)領(lǐng)域[3]，目前國內(nèi)外有很多學(xué)者們使用PLGA 作為殼載體來包埋藥物制作納米微球[4～6]。PLGA 作為納米粒微球成膜材料，將其內(nèi)的藥物與外界隔開，減少外界環(huán)境與藥物之間的相互影響，達(dá)到較高的包封率，是親水性藥物的理想載體[7～9]。

1 材料和方法

1.1 試劑與儀器

三七皂苷R1（上海源葉生物科技有限公司）；聚乳酸- 羥基乙酸共聚物（PLGA，相對(duì)分子質(zhì)量，LA∶GA=50∶50，Aladdin industrial Corporation）；二氯甲烷、聚乙烯醇（Polyvinyl alcohol,PVA，Sigma-Aldrich Corporation）。

超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司，SCIENTZ-IID）；高效液相色譜儀（Agilent1260 Infinity）；Hypersil GOLD 液相色譜柱（250×4.6mm×5μm，Thermoscientific）；Malvern 激光粒度分析儀（英國馬爾文公司）；磁力攪拌器（溫州標(biāo)諾儀器有限公司，78-1）、低溫冷凍離心機(jī)（AllegraR X-15R）；超純水儀（西安優(yōu)普儀器設(shè)備有限公司，UPT-I-5/10/20T）；電子天平（Precisa ES225SM-DR）。

1.2 三七皂苷R1-PLGA 微球的制備及參數(shù)優(yōu)化

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1 The factors and levels for the orthogonal experiment

采用復(fù)乳- 溶劑揮發(fā)法制備以PLGA 為攜藥載體的納米粒微球。精密稱取一定質(zhì)量的PLGA 并放入一定體積的二氯甲烷中，振蕩使其充分溶解，制成PLGA- 二氯甲烷溶液（油相O）；稱取一定質(zhì)量的三七皂苷R1 并制成相應(yīng)濃度的PNS 水溶液作為內(nèi)水相 W1；PVA 水溶液（1%）作為外水相 W2。以一定體積比混合W1相與O 相，將混合乳液置入超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)進(jìn)行第一次超聲乳化（300W，T1），制得初乳（W1/O），將初乳W1/O 快速加入到一定體積的外水相W2中，再次置入超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)進(jìn)行第二次超聲乳化（300W，T2），即可得到復(fù)乳。將得到的復(fù)乳置于室溫下攪拌4h，使得有機(jī)溶劑揮發(fā)，即得三七皂苷R1-PLGA 納米微球混懸液。將上述液體分裝入離心管內(nèi)，高速離心（4000r/min）5min,收集上清液，蒸餾水洗滌三次收集全部上清液。洗滌后的混懸液沉淀干燥后收集即得納米粒干粉，置4℃冰箱中保存、備用。在前期預(yù)實(shí)驗(yàn)單因素分析后篩選出在制備過程中對(duì)包封率及粒徑有影響的五種因素，X1（O 相PLGA 濃度，mg/mL）、X2（W1與O 相體積比）、X3（外水相 W2與初乳 W1/O 體積比）、X4（第一次超聲乳化時(shí)間，T1）、X5（第二次超聲乳化時(shí)間，T2）；每個(gè)因素選4 個(gè)水平，按L16（45）正交表安排實(shí)驗(yàn)，水平重復(fù)每一相同實(shí)驗(yàn)三次，見表1。

1.3 三七皂苷R1 含量測(cè)定

使用儀器：高效液相色譜儀（Agilent 1260 Infinity）及HypersilGOLD液相色譜柱（250×4.6mm×5μm，Thermoscientific）。以乙腈為流動(dòng)A 相，水為流動(dòng)B相，按照下表2 進(jìn)行梯度洗脫；進(jìn)樣量20μL；流速1.0mL/min；檢測(cè)波長203nm。

表2 高效液相梯度洗脫條件Table 2. Gradient elution conditions in high performance liquid phase

1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

三七皂苷R1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：分別稱取一定質(zhì)量三七皂苷R1，配制不同濃度三七皂苷R1 溶液，按照前述1.3 色譜條件得到的結(jié)果，以峰面積（A）對(duì)質(zhì)量濃度（ρ）進(jìn)行線性回歸，得到三七皂苷R1 標(biāo)準(zhǔn)曲線：A=2.9943ρ+3.2929（r=0.9803）。

1.5 包封率的測(cè)定

取1.2 項(xiàng)下離心收集的所有上清液，據(jù)1.3 色譜條件，測(cè)定游離藥物量（cfree），按以下公式計(jì)算包封率（entrapmentefficiency，EE%）=（ctotal-cfree/ctotal）×100%。

2 結(jié)果與討論

2.1 正交試驗(yàn)結(jié)果及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

以正交試驗(yàn)各序號(hào)對(duì)應(yīng)試驗(yàn)條件制備的三七皂苷R1-PLGA 微球的包封率（%）及平均粒徑為指標(biāo)，結(jié)果如表3。馬爾文粒徑分析儀得出的微球粒徑如圖1 所示。

圖1 三七皂苷R1-PLGA 微球粒徑分析圖Fig. 1 The analysis of particle size of PLGA loaded panax notoginseng saponin R1 nanoparticles

使用SPSS 13.0 對(duì)表3 數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果如表 4～7。

表3 三七皂苷R1-PLGA 包封率及粒徑正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表Table 3 The orthogonal experiment results of the encapsulation rate and particle size of PLGA loaded panax notoginseng saponin R1 nanoparticles

表4 三七皂苷R1-PLGA 微球包封率單因素分析表Table 4 The single factor analysis of encapsulation rate of PLGA loaded panax notoginseng saponin R1 nanoparticles

表5 三七皂苷R1-PLGA 微球包封率正交實(shí)驗(yàn)方差分析結(jié)果表Table 5 The variance analysis of encapsulation rate of PLGA loaded panax notoginseng saponin R1 nanoparticles

表6 三七皂苷R1-PLGA 微球粒徑單因素分析表Table 6 The single factor analysis of particle size of PLGA loaded panax notoginseng saponin R1 nanoparticles

表7 三七皂苷R1-PLGA 微球粒徑正交實(shí)驗(yàn)方差分析結(jié)果表Table 7 The variance analysis of particle size of PLGA loaded panax notoginseng saponin R1 nanoparticles

由表 4～7 可知，對(duì)于包封率和粒徑來說，X1、X2、X3、X4、X5五個(gè)因素均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。對(duì)于包封率的影響，五個(gè)因素次序依次為X1>X3>X5>X2>X4。對(duì)于包封率來說，要達(dá)到最佳包封率，每個(gè)因素最佳的水平分別為：PLGA 濃度10mg/mL，W1∶O為 3∶10，W2∶W1/O 為 10∶1，第一次超聲乳化時(shí)間（T1）10s，第二次超聲乳化時(shí)間（T2）90s；對(duì)于粒徑的影響，五個(gè)因素次序依次為X1>X2>X3>X5>X4。對(duì)于粒徑來說，要達(dá)到最小粒徑，每個(gè)因素最佳的水平分別為：PLGA 濃度 20mg/mL，W1∶O 為 2∶5，W2∶W1/O 為 2∶1，第一次超聲乳化時(shí)間（T1）10s，第二次超聲乳化時(shí)間（T2）120s。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的納米粒由PLGA 包覆三七皂苷R1，由于三七皂苷R1 是水溶性藥物，因此采用了適宜水溶性藥物包封的復(fù)乳- 溶劑揮發(fā)法。并且在外水相中加入了一定濃度的PVA 作為乳化劑,使得有機(jī)相在乳化劑作用下于水相中分散成細(xì)小液滴，保證足夠的表面活性劑分子覆蓋有機(jī)相與外部水相界面，提高液滴的聚結(jié)保護(hù)作用[5]。通過正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)考察各因素，以包封率及粒徑為指標(biāo)進(jìn)行優(yōu)化制備工藝。正交設(shè)計(jì)五因素四水平實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)于包封率和粒徑來說，PLGA 濃度，W1與O 相體積比、外水相W2與初乳W1/O 體積比、第一次超聲乳化時(shí)間、第二次超聲乳化時(shí)間對(duì)其均有影響。PLGA濃度過低，不足以完全包封體系中的三七皂苷R1，而當(dāng)PLGA 濃度過高時(shí)，體系內(nèi)的三七皂苷R1 濃度不變，PLGA 相對(duì)過剩，反而不能有效提高包封率，故當(dāng)PLGA 濃度在20mg/mL 時(shí)包封率達(dá)到最佳；內(nèi)水相體積增大，在一定范圍內(nèi)包封率上升，但當(dāng)上升至一定程度時(shí)反而包封率下降，最佳的內(nèi)水相與油相比值為3∶10，這與文獻(xiàn)報(bào)道的相符[10]。而隨著外水相與初乳（W1/O）體積比的增加，包封率上升，并且在300W 超聲乳化下，第一次內(nèi)水相油相混合乳化時(shí)間為10s，第二次外水相與初乳混合乳化時(shí)間為90s 時(shí)則包封率最高。對(duì)于納米粒微球粒徑來說，隨著PLGA 濃度的增加，粒徑逐漸減小,與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道的相符[11]；內(nèi)水相、油相比也影響著粒徑的大小，當(dāng)比值較大時(shí)粒徑較大，減小比值則粒徑減?。欢馑嗯c初乳的比值增大，則粒徑也增大。隨著第一次超聲乳化時(shí)間的延長，粒徑增加，這與文獻(xiàn)相符[4]，因此內(nèi)水相與油相超聲乳化時(shí)間選擇10s 為佳。

綜上所述，可以使用復(fù)乳- 溶劑揮發(fā)法成功制備三七皂苷R1-PLGA 納米粒微球，其包封率及粒徑大小會(huì)受PLGA 濃度，W1與O 相體積比、外水相W2與初乳W1/O 體積比、第一次超聲乳化時(shí)間、第二次超聲乳化時(shí)間影響。要獲得最大包封率，優(yōu)化后的實(shí)驗(yàn)條件為：PLGA 濃度 10mg/mL，W1∶O 為 3∶10，W2∶W1/O 為10∶1，第一次超聲乳化時(shí)間（T1）10s，第二次超聲乳化時(shí)間（T2）90s。如果要獲得最小粒徑，則優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件為：PLGA 濃度 20mg/mL，W1∶O為 2∶5，W2∶W1/O 為 2∶1，第一次超聲乳化時(shí)間（T1）10s，第二次超聲乳化時(shí)間（T2）120s。