邢瀚文，韓瑋，施文正,2,3，李曉暉,2,3*

1(上海海洋大學 食品學院，上海，201306) 2(上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術研究中心，上海，201306) 3(農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風險評估實驗室(上海)，上海，201306)

膠原蛋白是動物體內(nèi)重要的蛋白質(zhì)，約占總蛋白含量的25%[1]。膠原蛋白肽，是膠原蛋白適度降解后形成的一種多肽，具有抗氧化、抑菌、免疫調(diào)節(jié)和降血糖等多種生理活性[2]。陸生生物組織曾是獲取天然膠原肽的主要來源，但由于禽流感、瘋牛病等疾病的潛在威脅和宗教習俗等原因，使得陸源性膠原肽無法大范圍應用，開發(fā)水產(chǎn)膠原蛋白活性肽成為國內(nèi)外熱門課題之一[3-5]。羅非魚是我國重要的養(yǎng)殖魚類，其魚皮中氨基酸組成合理且膠原蛋白含量較高，但在粗加工中通常被當作下腳料丟棄或制成廉價飼料，造成嚴重的環(huán)境污染和資源浪費[6]。充分利用現(xiàn)有的水產(chǎn)資源，最大限度地提高產(chǎn)品附加值，是水產(chǎn)品綜合開發(fā)利用的一個重要方向，因此尋找新型加工技術突破產(chǎn)業(yè)發(fā)展瓶頸，對于羅非魚和膠原蛋白肽產(chǎn)業(yè)具有極大的現(xiàn)實意義。

目前，制備膠原肽最常用的是微生物發(fā)酵法和酶法。與酶法相比，采用微生物發(fā)酵法制備膠原蛋白肽，微生物產(chǎn)酶和提取水解膠原得到膠原蛋白肽可以同步完成，無需使用化學試劑和昂貴的酶制劑，并且能夠去除魚皮中的腥臭味，提高樣品感官質(zhì)量，極大節(jié)約生產(chǎn)成本，提高生產(chǎn)效率[7]。固態(tài)發(fā)酵(solid-state fermentation,SSF)相對于液態(tài)發(fā)酵而言，能耗低，對生產(chǎn)設備要求不高，不易被雜菌污染，目標產(chǎn)物濃度高，對環(huán)境友好，具有大規(guī)模生產(chǎn)活性肽的優(yōu)勢[8-9]。

天然膠原分子具有獨特的三股螺旋結構，只能經(jīng)膠原酶水解破壞超螺旋結構后才可被其他蛋白酶裂解[10]。因此，本研究以膠原酶活力為評價指標，通過單因素及正交試驗優(yōu)化確定枯草芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵羅非魚皮產(chǎn)酶的最佳條件，并對制備的膠原粗肽進行了超濾分離，研究不同分子質(zhì)量肽段的膠原肽體外抗氧化活性，以期為水產(chǎn)品的深入開發(fā)利用提供技術參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

羅非魚魚皮,雷州市龍之潤水產(chǎn)品有限公司；BacillussubtilisCCTCC AB 90008,中國典型培養(yǎng)物保藏中心；營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(nutrient agar,NA),青島海博生物有限公司；甘氨酸,Sigma公司；截流分子5、10 kDa Millipore再生纖維素超濾膜及其他分析純試劑,國藥化學試劑有限公司。

1.2 主要儀器與設備

Heraeus Pico 17高速離心機，美國賽默飛世爾科技有限公司；UV-1800 PC型紫外可見分光光度計，上海美譜達儀器有限公司；L-8800氨基酸自動分析儀，日本Hitachi公司；Free Zone 2.5真空冷凍干燥機，美國Labconco公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 魚皮的預處理

將魚皮去鱗除雜，洗凈后充分瀝干，切分成約1 cm×1 cm×1 cm的碎塊并經(jīng)打粉機粉碎，冷凍至-20 ℃，密封備用。

1.3.2 固態(tài)發(fā)酵及粗酶液的制備

將B.subtilisCCTCC AB 90008從甘油保藏管接種至營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，將活化好的菌種接至種子培養(yǎng)基(牛肉膏3 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 5 g/L，pH 7.2～7.4)中，于37 ℃、120 r/min搖床培養(yǎng)一定時間，制得種子液。將10 g處理后魚皮裝入250 mL錐形瓶中，121 ℃高溫滅菌20 min，在無菌條件下加入一定量的滅菌蒸餾水，作為固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基。調(diào)節(jié)培養(yǎng)基初始pH，按菌種接種量50 g/L 接入培養(yǎng)好的發(fā)酵種子液，恒溫靜置培養(yǎng)，并每隔5 h搖瓶翻動1次，相應的發(fā)酵條件按照單因素試驗設計實施。

發(fā)酵結束后，向魚皮培養(yǎng)基中加入50 mL 0.1 mol/L檸檬酸鈉緩沖液(pH 6.2)，于5 000 r/min離心15 min，取上清液作為膠原酶粗酶液。

1.3.3 固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)膠原酶條件的優(yōu)化

單因素試驗以膠原酶活力為評價指標，逐級優(yōu)化，先后考察培養(yǎng)基初始pH(6、6.5、7、7.5和8)、菌齡(6、10、14、18、22和26 h)、加水量(5、10、15、20和25 mL)、發(fā)酵溫度(20、25、30、35和40 ℃)、發(fā)酵時間(12、18、24、30和36 h)5個因素對菌株產(chǎn)酶的影響。

根據(jù)單因素試驗結果，選取菌齡、加水量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間進行4因素3水平的正交試驗，優(yōu)化枯草芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵羅非魚皮制備膠原蛋白肽的工藝條件。

1.3.4 羅非魚皮膠原蛋白肽的制備工藝

羅非魚皮粉→高溫滅菌(121 ℃，20 min)→加水并調(diào)節(jié)pH→接種→發(fā)酵→加水過濾(紗布)→滅酶(90 ℃，10 min)→離心(8 000 r/min，15 min)→收集上清液→過濾(0.45 μm濾膜)→收集濾液凍干→固態(tài)發(fā)酵羅非魚皮膠原蛋白粗肽(SSF-TSCP)

1.3.5 水解度的測定

采用甲醛滴定法測定SSF-TSCP中氨基氮的含量[11]，參照GB 5009.5—2016《食品安全國家標準 食品中蛋白質(zhì)的測定》[12]測定預處理好的羅非魚皮中總氮含量，水解度(degress of hydrolysis,DH)計算如公式(1)所示：

(1)

式中：h1，氨基態(tài)氮含量，mg/mL；h2，總氮含量，mg/mL。

1.3.6 多肽含量的測定

稱取樣品2 g，加入10 mL 150g/L三氯乙酸溶液，混合均勻，靜置5 min，在3 000 r/min下離心10 min后，取全部上清液，參照GB 5009.5—2016《食品安全國家標準 食品中蛋白質(zhì)的測定》[12]測定上清液中多肽含量。

1.3.7 氨基酸分析

采用GB 5009.124—2016《食品安全國家標準 食品中氨基酸的測定》[13]的方法，測定分析樣品中氨基酸組成及含量。

1.3.8 膠原蛋白肽的分離制備

1.3.9 膠原酶活力的測定

將甘氨酸作為標準氨基酸，以Ⅰ型膠原蛋白為底物，采用茚三酮顯色法[14]測定膠原酶活力。酶活力定義為：在37 ℃，pH 7.5的條件下，每分鐘水解膠原蛋白產(chǎn)生1 μg甘氨酸所需的酶量為1個酶活力單位(U)。

1.3.10 還原能力的測定

參考OYAIZU[15]的方法并略作改動，以谷胱甘肽(glutathione,GSH)作為陽性對照。

1.3.11 ·OH清除能力的測定

參考SMIRNOFF等[16]的方法并略作改動：向2 mL樣品溶液中加入2 mL 6 mmol/L FeSO4溶液和2 mL 6 mmol/L水楊酸-乙醇溶液混合，最后加入2 mL 8.8 mmol/L H2O2溶液，于37 ℃水浴保溫20 min，在510 nm波長處測定，即為樣品組的吸光度?？瞻讓φ战M以蒸餾水代替樣品溶液，本底組以蒸餾水代替H2O2溶液，以GSH作為陽性對照。·OH清除率的計算如公式(2)所示：

(2)

式中：A，樣品組的吸光度；A1，本底組的吸光度；A0，空白組的吸光度。

(3)

式中：A，樣品組的吸光度；A1，本底組的吸光度；A0，空白組的吸光度。

1.3.13 DPPH自由基清除能力的測定

DPPH可在有機溶劑中形成穩(wěn)定的自由基[18]。參考NURDIANI等[19]的測定方法并略作改動，以GSH作為陽性對照。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有實驗均重復3次，采用SPSS 20、Origin 8.5等軟件進行統(tǒng)計分析及繪圖。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 初始pH對產(chǎn)酶的影響

如圖1所示，隨著起始pH的增大，膠原酶酶活力和菌體生物量先升高后緩慢降低。環(huán)境偏酸或偏堿時，均不利于菌體生長，影響膠原酶的合成與積累。在初始pH接近7的中性環(huán)境中，菌株生長良好且產(chǎn)膠原酶活性最高，故本試驗選擇pH 7為培養(yǎng)基的最適pH。

圖1 初始pH對菌株產(chǎn)膠原酶的影響Fig.1 Effect of initial pH on the production of collagenase

2.1.2 菌齡對產(chǎn)酶的影響

如圖2所示，接入的種子液菌齡<18 h時，在培養(yǎng)一定時間后，檢測到酶活力較低，生物量也偏低。當菌齡>18 h時，雖然菌體生長旺盛但衰老迅速，產(chǎn)膠原酶活性有下降趨勢，故本試驗選擇18 h為種子液最適培養(yǎng)時間。

圖2 菌齡對菌株產(chǎn)膠原酶的影響Fig.2 Effect of cell age on the production of collagenase

2.1.3 加水量對產(chǎn)酶的影響

在固態(tài)發(fā)酵中，含水量過高會導致培養(yǎng)基質(zhì)多孔性降低，發(fā)酵系統(tǒng)難以換氣、降溫，從而增加被雜菌污染的風險；而含水量過低時，基質(zhì)膨脹程度低，菌體生長代謝受到抑制，導致目標物產(chǎn)量下降[20]。如圖3所示，當加水量為10 mL時，菌株固態(tài)發(fā)酵羅非魚皮產(chǎn)膠原酶活性最高，故本試驗選擇10 mL為最適加水量。

圖3 加水量對菌株產(chǎn)膠原酶的影響Fig.3 Effect of water addition on the production of collagenase

2.1.4 發(fā)酵溫度對產(chǎn)酶的影響

最佳發(fā)酵溫度受菌株生長狀態(tài)和培養(yǎng)基理化性質(zhì)等因素的影響而改變，適合微生物生長繁殖的溫度不一定有利于某種代謝產(chǎn)物的合成[21]。如圖4所示，在發(fā)酵溫度<35 ℃時，菌體生物量較多，但產(chǎn)酶活性偏低。在35 ℃時，菌體生長代謝旺盛，膠原酶分泌增多，酶活力達到最大，此后溫度繼續(xù)上升，菌體生長受到抑制，酶活力也迅速下降，說明該菌最適生長溫度與最適產(chǎn)酶溫度不同，故本試驗選擇35 ℃為最適發(fā)酵溫度。

圖4 發(fā)酵溫度對菌株產(chǎn)膠原酶的影響Fig.4 Effect of fermentation temperature on the production of collagenase

2.1.5 發(fā)酵時間對產(chǎn)酶的影響

如圖5所示，延長發(fā)酵時間，菌體生物量隨之增多，膠原酶的酶活力也逐漸增大，在發(fā)酵時間達到24 h時，膠原酶酶活力達到最大值。隨著該菌生長進入穩(wěn)定期，有害產(chǎn)物積累抑制菌株產(chǎn)酶，酶活力呈下降趨勢。在生產(chǎn)實踐中隨著培養(yǎng)時間的延長，雜菌污染的機會相應增加，綜合考慮生產(chǎn)成本和發(fā)酵效率，故本試驗選擇24 h為最適發(fā)酵時間。

圖5 發(fā)酵時間對菌株產(chǎn)膠原酶的影響Fig.5 Effect of fermentation time on the production of collagenase

2.2 正交優(yōu)化試驗結果

2.2.1 正交試驗設計與結果

在單因素試驗的基礎上，選取對產(chǎn)酶活性影響較顯著的菌齡(A)、加水量(B)、發(fā)酵溫度(C)和發(fā)酵時間(D)4個因素，進行L9(34)正交試驗，試驗設計及結果見表1。

2.2.2 正交試驗方差分析

由表1可知，各因素對膠原酶酶活力的影響程度大小依次是C>D>A>B，固態(tài)發(fā)酵羅非魚皮產(chǎn)膠原酶的最優(yōu)方案為A1B2C2D2，即種子液菌齡14 h，加水量10 mL，發(fā)酵溫度35 ℃，發(fā)酵時間24 h。采用該條件進行3次平行實驗，測得膠原酶的酶活力為90.05 U/mL，與優(yōu)化前的64.27 U/mL相比，酶活力提高約40.1%。方差分析(表2)顯示，發(fā)酵溫度和發(fā)酵時間對膠原酶活性具有顯著影響(P<0.05)。

表1 正交試驗設計方案及結果Table 1 Design scheme and results of orthogonal test

表2 方差分析結果Table 2 Variance analysis of the orthogonal test

2.3 氨基酸組成分析

表3 SSF-TSCP的氨基酸組成Table 3 Amino acid composition of SSF-TSCP

2.4 體外抗氧化活性測定結果

2.4.1 還原能力

還原力是通過評價多肽得失電子和穩(wěn)定自由基的能力來衡量抗氧化活性的重要指標[28]。如圖6所示，SSF-TSCP及其分離組分TSCP-a、TSCP-b、TSCP-c均有一定的還原能力，且隨著樣品質(zhì)量濃度的增加，各組分還原能力也逐漸增強。當質(zhì)量濃度達到5 mg/mL時，組分TSCP-c的還原能力為0.962，高于SSF-TSCP(0.783)，TSCP-a和TSCP-b的還原能力在該質(zhì)量濃度下較弱，分別為0.588和0.621。馬華威等[29]制備的鮟鱇魚皮膠原蛋白肽在質(zhì)量濃度10 mg/mL時測定還原能力，其OD700 nm僅為0.676。

圖6 不同膠原肽組分和GSH的還原能力Fig.6 Reducing power of different collagen peptide fractions and GSH

2.4.2 ·OH清除能力

·OH作為生物體內(nèi)最活躍的活性氧自由基，可以降解DNA和細胞膜等，造成重要細胞的死亡和突變，危害機體健康[28]。如圖7所示，在質(zhì)量濃度為1～4 mg/mL時，隨著質(zhì)量濃度的提高，樣品的·OH清除能力增強趨勢明顯，若質(zhì)量濃度繼續(xù)升高，其變化趨于平緩。在質(zhì)量濃度為5 mg/mL時，組分TSCP-c的清除率為59.24%，低于GSH。對質(zhì)量濃度和清除率之間作回歸方程并計算半抑制濃度(half inhibitory concentration,IC50)，得到SSF-TSCP、TSCP-a、TSCP-b和TSCP-c 4種樣品的IC50值分別為9.01、7.41、7.92和3.83 mg/mL。MW<5 kDa的多肽組分TSCP-c清除·OH效果最好，其IC50值低于虎斑烏賊生殖腺多肽(19.4 mg/mL)[30]和金槍魚多肽(28.81 mg/mL)[31]。

圖7 不同膠原肽組分和GSH的·OH清除能力Fig.7 Hydroxyl radical scavenging abilities of different collagen peptide fractions and GSH

圖8 不同膠原肽組分和GSH的清除能力Fig.8 Superoxide anion radical scavenging abilities of different collagen peptide fractions and GSH

2.4.4 DPPH自由基清除能力

如圖9所示，SSF-TSCP及其分離所得的3個多肽組分均有較好的DPPH自由基清除能力，清除率與其質(zhì)量濃度呈正相關。當質(zhì)量濃度為5 mg/mL時，TSCP-c的清除率最高，可達到70.23%，TSCP-a的清除活性最低，為48.13%。這與2者還原能力的表現(xiàn)相同，可能是由于這2種判定抗氧化能力的方法均是基于多肽給電子能力的原理測定。

圖9 不同膠原肽組分和GSH的DPPH自由基清除能力Fig.9 DPPH radical scavenging abilities of different collagen peptide fractions and GSH

對質(zhì)量濃度和清除率之間作回歸方程并計算得到SSF-TSCP、TSCP-a、TSCP-b和TSCP-c 4種樣品的IC50值分別為5.26、7.81、6.47和2.37 mg/mL。田裕心等[34]報道的鮑魚內(nèi)臟多肽(4.61 mg/mL)和CHI等[35]報道的綠鰭馬面鲀魚皮膠原肽(5.22 mg/mL)對DPPH自由基的清除活性均小于TSCP-c。SSF-TSCP的還原力高于TSCP-a、TSCP-b，但其清除DPPH自由基的能力卻低于這兩者，可能是由于多肽的自由基清除活性較還原力而言受到的影響因素更多也更為復雜，如pH、分子質(zhì)量等[36]。

3 結論