于冰冰,李揚,邵晨

（吉林大學基礎醫(yī)學院病理生理學系，吉林 長春 130021）

前列腺癌（prostate cancer，PCa）是男性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，在世界范圍內，PCa 發(fā)病率在所有男性惡性腫瘤中位居第2 位，2018 年全世界約有36 萬人死于PCa 相關疾病，是全球男性腫瘤死亡的第五大原因［1］。近年來，隨著我國人口老齡化和生活方式的改變，PCa 患者的發(fā)病率和死亡率呈明顯上升趨勢，已成為影響我國男性健康的重要疾病之一。由于早期PCa 常無癥狀，與歐美發(fā)達國家比較，我國對PCa 易感人群的篩查工作相對落后，初診患者晚期PCa 比例更高［2-4］。

目前，PCa 的治療手段主要包括PCa 根治術、放射治療、全身化療和雄激素阻斷治療（androgen deprivation therapies，ADT）等［5］。ADT 是轉移性PCa 的標準治療方法，是通過抑制雄激素分泌和拮抗雄激素受體（androgen receptor，AR）的作用阻斷AR 轉錄，包括手術去勢法和藥物去勢法［6］。由于PCa 存在雄激素依賴性，ADT 對多數PCa 患者早期治療效果良好，可延緩激素敏感性PCa 進展，因此被作為臨床上常規(guī)的PCa 治療方式。然而，ADT 并不能治愈PCa，在經歷18～24 個月有效期后，幾乎所有患者均會發(fā)生激素抵抗并產生耐藥性，逐漸且不可逆地演變?yōu)槿莸挚剐郧傲邢侔╟astration resistant prostate cancer，CRPC），并且多數患者伴有骨轉移以及遠處臟器轉移［7］。CRPC 是指PCa 患者經過初次持續(xù)ADT 治療后，血清睪酮水平達到去勢水平（＜1.7 nmol·L－1），但疾病依然進展的PCa。CRPC 表現為雄激素非依賴性，并且惡性程度更高，是導致臨床治療失敗和患者死亡的主要原因。

雖然CRPC 患者雄激素合成被阻斷，但多數CRPC 患者仍可表達AR，AR 信號通路異常激活是促進癌細胞生存和生長的決定性因素［8］。研究［9］顯示：雄激素受體可變剪接異變體7（androgen receptor splice variant 7，AR-V7）在CRPC 腫瘤細胞和組織中表達水平較高，AR-V7 陽性患者預后較差。近年來研究［10］表明：AR-V7 在PCa 對紫杉烷類及AR 靶向藥物耐藥性的形成過程中具有促進作用，但是AR-V7 誘導PCa 細胞耐藥性產生的具體分子機制尚不清楚?，F就AR-V7 在CRPC 發(fā)生發(fā)展和耐藥過程中的作用，探討AR-V7 誘導PCa 細胞耐藥的分子機制，為AR-V7 作為CRPC診斷及預后生物標志物和治療新靶點提供理論依據。

1 AR 的結構和功能

AR 屬于類固醇激素受體超家族中的一員，是存在于正常前列腺組織中的一種配體依賴性轉錄調節(jié)因子，可調控其下游基因的表達。正常情況下，AR 與5α-雙氫睪酮（dihydrotestosterone，DHT）和睪酮結合是男性性別分化及發(fā)育的先決條件，AR 在細胞核中與其下游基因，如前列腺特異性抗原（prostate specific antigen，PSA）和跨膜絲氨酸蛋白酶 2（transmembrane protease serine 2，TMPRSS2）的啟動子結合，募集多種轉錄共調節(jié)因子，維持細胞生長和存活［11］。但是，AR 同時也存在于PCa 細胞中，在PCa 的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。全長AR（full-length androgen receptor，AR-FL）由4 個結構域構成（圖1）［8，11-12］：①具有獨立轉錄活化功能的氨基端結構域（N-terminal domain，NTD），為外顯子1 編碼，轉錄共調節(jié)因子可與其特異性結合位點結合，缺乏LBD 或雄激素時可激活靶基因的轉錄，在AR 轉錄活化中起關鍵作用。②高度保守的DNA 結合結構域（DNAbinding domain，DBD），為外顯子2 和3 編碼，其作為特異性堿基的結合位點可識別靶基因中的雄激素反應元件（androgen response elements，AREs），與靶基因結合并控制其表達。③配體結合結構域（ligand-binding domain，LBD），為外顯子4～8 編碼，雄激素與AR 結合的位點，負責激素識別并保證信號傳導途徑的特異性和選擇性。④連接DBD 和LBD 的鉸鏈區(qū)（hinge domain，HD），為外顯子4 編碼，包含核定位信號（nuclear localization signal，NLS），能夠介導AR 核轉運以及調節(jié)AR 與DNA 結合、共活化因子的募集以及AR 的N-C 二聚化。當雄激素與AR 的LBD 在細胞質結合后，AR 結構發(fā)生改變，AR 的NTD 與LBD通過N-C 端相互作用進行分子內二聚化，導致鉸鏈區(qū)的NLS 暴露，在核轉運子的協助下從細胞質轉移到細胞核。激活后AR 的DBD 可與雄激素反應元件（AREs）結合，誘導轉錄復合物的組裝，調控包括 PSA、TMPRSS2 和己糖激酶 2（hexokinase 2，HK2）在內的下游基因表達，促進PCa 的發(fā)生發(fā)展和轉移。

圖1 AR-FL 和AR-V7 結構示意圖Fig.1 Structure diagram of AR-FL and AR-V7

2 AR 信號通路的異常激活機制

在雄激素耗盡的情況下AR 仍可被激活。在CRPC 中盡管雄激素水平被抑制，但AR 信號通路異常激活在CRPC 中仍起著至關重要的作用。目前AR 異常激活主要包括以下幾種途徑：①AR 基因擴增。CRPC 的發(fā)展與AR 基因擴增或其他機制導致的AR 表達增加有關，但AR 基因擴增并不是AR信號通路異常激活的主要原因［13］。②AR 基因突變。多數已檢測到的突變位于LBD，可導致AR 雄激素非依賴性激活，這也是ADT 后PCa 細胞產生抗性的原因之一。研究［14］表明：雄激素缺乏或抗雄激素的藥物存在是AR 基因突變的選擇壓力，用AR 靶向藥物治療可增加AR 基因突變的發(fā)生率。③AR 的翻譯后修飾。在ADT 期間持續(xù)激活的AR轉錄活性可能是AR 翻譯后磷酸化修飾所致。研究［15］顯示：Src 基因（sarcoma gene）誘導AR 的Y534 位點磷酸化可導致AR 對低水平雄激素敏感和AR 的雄激素非依賴性激活。上皮和內皮酪氨酸激酶（epithelial and endothelial tyrosine kinase，Etk）作為非受體型酪氨酸激酶和Src 與磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）的下游效應物，其表達在ADT 期間明顯上調，并能夠通過在Y534 和Y551/Y552 位點磷酸化AR 從而穩(wěn)定AR 并在無雄激素時促進AR 活性［12］。④AR 共激活因子過表達。染色質免疫沉淀實驗結果顯示：在CRPC 細胞中AR 共激活因子MED1 和AR 協作因子FoxA1、GATA2 活性增強，而沉默這些因子可使AR 下游基因（UBE2C）表達水平降低。白細胞介素6 介導的核受體輔激活因子1（NCoA1 或Src1）的磷酸化以配體非依賴性方式促進AR 轉錄，而且絲裂原活化蛋白激酶（mitogenic activated protein kinase，MAPK）介導的該共激活因子的磷酸化可能增加AR 與雄激素的親和性，導致疾病復發(fā)和CRPC 的進展［16］。⑤AR 可變剪接異變體（androgen receptor splice variants，ARVs）的表達。2008 年以來，研究者在轉移性PCa 中陸續(xù)發(fā)現了20 多種ARVs。ARVs 表達是AR 持續(xù)激活、PCa 細胞生存以及ADT 后疾病進展的重要機制之一［16］。隨著相關研究的不斷深入，研究者認為ARVs 的發(fā)現具有重要的臨床意義，ARVs 表達水平與腫瘤進展加速和生存期較短有密切關聯，且可能作為預測PCa 患者預后的標志物［17］。多數ARVs 缺乏LBD，即使在沒有配體的情況下，也具有轉錄活性。AR 活性受到ARVs 調控：ARVs 活化導致類固醇生成酶上調，可為AR 提供更多配體；同時，ARVs 可增加AR 調節(jié)基因的表達，導致AR 信號通路在配體缺失條件下異常激活［18］。雖然在PCa 細胞中通過雄激素拮抗劑抑制LBD 可增加ARVs 的表達，但ARVs 表達的調控機制尚不清楚。

3 PCa 中ARVs 的產生及結構

ARVs 最早發(fā)現于21 世紀初期，不同的研究團隊在PCa 細胞系（22Rv1、VCaP 和CWR-R1）、人異種移植物（LuCaP 86.2 和LuCaP 136）和臨床PCa標本中共發(fā)現17種缺乏LBD 的ARVs［16］。良性前列腺組織中也可以檢測到ARVs，但其在正常前列腺組織或細胞中的作用尚不清楚。ARVs 可能在驅動腫瘤起始中不發(fā)揮作用，但在ADT 期間驅動腫瘤進展中發(fā)揮作用。部分ARVs 具有組成型活性，在沒有配體激活條件下即可表現出一定程度的活性，如AR-V7（也稱為AR3）和ARv567es（也稱為AR-V12）［17］；而另一部分ARVs 則需要在配體激活條件下才具有活性，如AR-V1 和AR-V9。除AR45 的NTD 截短，其他變體均含有完整的NTD，但缺乏與雄激素結合的LBD。多數ARVs均含有完整的DBD，可以與靶基因結合，調控靶基因表達［13］。

ARVs 可能是體細胞無義突變、AR 基因中提前引入終止密碼子、AR 基因重排或AR 蛋白翻譯后水解的產物，上述遺傳和表觀遺傳機制介導了ARVs 的產生［13，16］。ARVs 最明顯的特征是缺乏編碼LBD 的開放閱讀框，可能是編碼DBD 的外顯子下游插入隱蔽外顯子或編碼C 末端結構域的外顯子的缺失所致。缺乏LBD 的AR 同種型是PCa 進展的重要因素，其在CRPC 進展和針對該結構域的治療中發(fā)揮重要作用。多數ARVs 保留NTD 與AF1 反式激活結構域和DBD，因此可組成性激活并且能夠獨立于配體維持基因轉錄。雄激素存在與否，ARVs 均定位于細胞核，導致AR 信號傳導途徑雄激素非依賴性激活。

在現已發(fā)現的ARVs 中，截短的變體AR-V7和外顯子跳躍變體ARv567es 在PCa 中具有重要的臨床意義，且兩者均在原發(fā)性前列腺腫瘤和轉移瘤中表達，主要區(qū)別是AR-V7 無HD，而ARv567es具有完整的HD［18］。ARv567es 和AR-V7 作為組成型活性受體，不依賴于LBD 即可增強AR 轉錄活性，促進AR-FL 表達，進而促進CRPC 進展［19］。研究［20-21］表明：在無雄激素的條件下，特異性敲低雄激素非依賴性細胞系22Rv1 和CWR-R1 中內源性AR-V7 和ARv567es 可抑制腫瘤細胞生長，恢復腫瘤細胞對雄激素和恩雜魯胺的反應。此外，AR-V7 和ARv567es 的過表達可在雄激素依賴性LNCaP 細胞中驅動其在ADT 期間繼續(xù)存活。由于AR-V7 是目前研究最多且是臨床上檢測到表達水平最高的ARVs，因此本文作者將以AR-V7 為核心探討其與PCa 發(fā)生發(fā)展的關系。

4 AR-V7 與AR 的關系

目前尚未發(fā)現獨立于AR 而單獨存在的AR-V7，表達AR-V7 的PCa 細胞也同時表達AR-FL，但細胞表達AR-FL 不一定同時表達ARV7，因此比較AR-V7 與AR 的異同對分析AR-V7的功能尤其重要。AR 靶基因的激活需要AR 共調節(jié)蛋白和其他轉錄協同因子共同作用，因此AR 活性不僅由雄激素介導，還受AR 同源二聚體及其輔助因子的相互作用。研究［21］顯示：AR-V7 也需要二聚化以發(fā)揮其轉錄活性。AR-V7 不僅可以同源二聚體化，還可以與AR 異二聚化，導致AR 的雄激素非依賴性核定位和轉錄活性。雖然AR-V7 與AR 存在許多重疊的靶基因，可以在特定條件下替代AR 調節(jié)下游基因的轉錄，但是AR 與AR-V7 分別介導不同的細胞周期基因表達譜，AR 主要調控與分子合成有關的基因，而AR-V7 可特異性增加包括UBE2C 在內的細胞周期相關基因的表達［22-23］。此外，AR-V7 還可以誘導上皮間質轉變（epithelial-mesenchymal transition，EMT），AR-V7的表達導致間充質標記物（N-鈣黏蛋白、波形蛋白、Snail 和Zeb1）上調［24-26］，上述研究證明轉移性PCa 標本中AR-V7 表達水平增加，表明AR-V7信號轉導與EMT 之間存在關聯，可能與PCa 的轉移和治療抗性有關聯［27-28］。此外，AR-V7 可以促進AR 的核轉移，并且協助AR 逃逸化療藥物對其核轉移和信號通路的抑制作用，從而促進PCa 耐藥性形成和CRPC 的進展。

5 AR-V7 與PCa 治療

多烯紫杉醇（docetaxel）是第一種與轉移性去勢抵抗性前列腺癌（metastatic castration-resistant prostate cancer，mCRPC）生存獲益相關的一線化療藥物，2004 年美國食品藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Administration，FDA）批準以多烯紫杉醇為基礎的化療藥物治療mCRPC［29］。盡管PCa 患者應用多烯紫杉醇治療后常會產生耐藥性，但多烯紫杉醇仍然廣泛應用于臨床。多烯紫杉醇通過影響細胞周期，使腫瘤細胞阻滯在有絲分裂期（G2/M 期），誘導腫瘤細胞凋亡，抑制腫瘤細胞生長［30-32］。多烯紫杉醇治療后，AR 信號仍然是PCa 生長的關鍵驅動因素。

鑒于AR 信號轉導在促進晚期PCa 發(fā)展中的關鍵作用，AR 靶向藥物被應用為多烯紫杉醇后CRPC 患者的主要用藥，為PCa 的治療提供了新思路。抑制雄激素合成和抑制雄激素與AR 結合的藥物相繼問世，現已經證實阿比特龍（abiraterone）和恩雜魯胺（enzalutamide）可有效延長CRPC 患者的總生存率［33］。①阿比特龍：FDA 于2011 年批準阿比特龍用于治療多烯紫杉醇治療效果不佳的CRPC 患者，可延長患者總生存期（overall survival，OS）。阿比特龍不可逆地拮抗細胞色素P450 C17（cytochrome P450 17A1，CYP-17），CYP-17 是雄激素合成中具有裂解酶和17-α 羥化酶活性的關鍵酶，阿比特龍可阻斷腎上腺、睪丸和前列腺中雄激素的合成，從而抑制PCa 細胞的生長。此外，阿比特龍還可通過抑制AR mRNA 的表達和降低AR 蛋白水平等阻斷AR信號通路［17］。②恩雜魯胺（MDV-3100）：恩雜魯胺于2012 年被FDA 批準用于治療mCRPC，是一種新型AR 拮抗劑，與AR 具有高度親和力，其通過與AR 的LBD結合，阻斷雄激素與AR 的結合，進而抑制AR 的核轉移、與DNA 的結合及其共激活物募集的能力，達到抑制AR 信號通路正常激活的作用，從而抑制PCa 細胞的生長和增殖，延緩PCa 的進展，可以作為紫杉醇治療失敗CRPC 患者的一線用藥［7，9，17］。

盡管上述藥物代表了CRPC 治療上的突破，但幾乎所有患者都不可避免地在1～2 年內產生耐藥性。在PCa 組織中，AR 的增殖或突變可使其對低含量的雄激素敏感，從而導致PCa 的進展［7］。最近研究［14］顯示：PCa 對阿比特龍和恩雜魯胺的耐藥性與ARVs 的表達有關。

5.1 AR-V7 與AR 靶向藥物AR-V7 是PCa 中最常見、表達量最高的一種ARVs，主要定位于細胞核。采用RT-PCR 法檢測AR-V7 mRNA 表達情況［12］，結果顯示：在CRPC 中AR-V7 mRNA 表達水平較正常組織增加約20 倍。在正常前列腺組織和早期PCa 細胞中AR-V7 蛋白表達水平極低，并且其表達水平隨著疾病進展而增加。PCa 臨床標本中AR-V7 mRNA 表達水平與蛋白表達水平間并不總是存在相關性，可能是由于使用了不準確的檢測方法，或者一些潛在因素抑制AR-V7 mRNA 的表達。AR-V7 由連續(xù)剪接的AR 外顯子1、2、3 及隱蔽外顯子3（cryptic exon 3，CE3）編碼，AR-V7具有完整的NTD 和DBD，但缺乏LBD 和HD，并由一段短肽序列代替。AR 的NLS 位于HD，但AR-V7 缺乏HD，NLS 由CE3 編碼，這種特殊結構使其持續(xù)活化，在無配體結合狀態(tài)下完成核轉運并激活AR 信號通路，招募輔助因子完成下游基因的轉錄激活。由于AR-V7 缺乏LBD，傳統(tǒng)的ADT藥物阿比特龍和恩雜魯胺均通過該區(qū)域發(fā)揮抑制作用，因此AR-V7 在協助PCa 細胞逃避恩雜魯胺和阿比特龍等藥物對AR 信號通路的抑制效應方面起著決定性作用，從而導致PCa 耐藥性和CRPC 的進展［17，19，34］。ADT 期間低水平雄激素的刺激以及廣泛應用AR 靶向藥物，導致AR-V7 持續(xù)激活，從而導致CRPC 復發(fā)和耐藥性的產生。

2014 年ANTONARAKIS 等［19］研究表明：CRPC 患者循環(huán)腫瘤細胞（circulating tumor cells，CTC）中AR-V7 mRNA 表達水平與恩雜魯胺和阿比特龍的耐藥性有關。與AR-V7 陰性患者比較，AR-V7 陽性患者PSA 反應率明顯降低，PSA 無進展生存期（PSA progression-free survival，PSAPFS）較短，臨床或影像學無進展生存期較短［35］。在臨床實踐中，AR-V7 在PCa 細胞對AR 靶向藥物耐藥性中的具有重要作用，可預測下一代AR 靶向藥物的抗性，故AR-V7 可作為CRPC 預后不良的生物標志物。由于AR-V7 可能參與AR 靶向藥物潛在逃逸過程，研究人員正在開發(fā)新的試圖通過識別和阻斷AR-V7 的AR 拮抗劑（EPI-001、ARN-509、VT-464、AZD3514 和ODM-201）。

AR-V7 與PCa 的發(fā)展存在密切關聯，AR-V7轉錄后調控也逐漸成為PCa 治療中的重要環(huán)節(jié)［36］，其中包括增加 PCa 中 AR-V7 蛋白降解。Galeterone 可誘導AR 和AR-V7 蛋白的降解，抑制CRPC 的進展；白藜蘆醇可以促進AR-V7 的降解。氯硝柳胺也可明顯下調AR-V7 蛋白水平。但目前對AR-V7 轉錄后調控模式的了解有限，仍需進一步探索。

5.2 AR-V7 與多烯紫杉醇多烯紫杉醇是廣泛用于mCRPC 的一線治療，屬于紫衫烷類化療藥物。多烯紫杉醇可與β-微管蛋白結合而減少其解聚作用，通過穩(wěn)定微管和抑制微管動力阻礙有絲分裂紡錘體形成，并持續(xù)激活紡錘體組裝檢查點（spindle assembly checkpoint，SAC），從而導致有絲分裂阻滯并最終導致細胞死亡［29，37］。近年來研究［38］表明：在多種PCa 細胞中，AR 活性與PCa 細胞對多烯紫杉醇的敏感性呈負相關關系，多烯紫杉醇主要通過干擾微管阻礙轉錄因子AR 入核，從而抑制AR 下游促生長基因（PSA 等）的表達發(fā)揮抑制細胞生長的作用。KUMORA 等［39］通過對比不同PCa 細胞中AR 活性和多烯紫杉醇敏感性的差異發(fā)現： AR 通路異常激活促進了多烯紫杉醇耐藥性的發(fā)生。

HD 是AR 與微管相互作用的部位，AR-V7 無法與微管蛋白相互作用，核定位不受紫杉醇類藥物的影響。AR-V7 可以通過激活AR 信號通路從而使PCa 細胞對多烯紫杉醇的敏感性降低，最終導致耐藥性。研究［39-40］表明：高表達AR-V7 后，PCa 細胞對多烯紫杉醇敏感性降低。AR-V7 也可通過調控其下游基因進而降低多烯紫杉醇對PCa 細胞的殺傷作用，具體作用機制仍需繼續(xù)探索。但是，許多臨床實驗結果并未證實AR-V7 在促進紫杉醇類藥物耐受的作用。此外，AR-V7 陽性CRPC 患者接受紫杉烷治療較AR 靶向治療效果明顯，而在AR-V7 陰性患者中，紫衫烷治療效果與阿比特龍和恩雜魯胺治療效果無明顯差異，提示AR-V7 的狀態(tài)可能是選擇 PCa 治療方式的可靠指標［5，21，30］。AR-V7 與PCa 患者紫杉醇耐受間的關系仍需要更多樣本的驗證和后續(xù)的深入研究。

6 AR-V7 的臨床應用評估

由于臨床上缺乏對個體ARVs 的特異性抗體檢測以及CRPC 相關的組織儲存不足，導致在臨床上驗證ARVs 的作用受到一定程度的限制，但目前證據表明ARVs 可能是PCa 進展的促進因素。GUO 等［15］通過免疫組織化學方法評估了CRPC 和良性腫瘤樣本中AR-V7 蛋白表達，結果顯示：44%的CRPC 樣本中AR-V7 蛋白呈陽性表達，而在良性腫瘤樣本中AR-V7 蛋白呈陰性表達，并且AR-V7 高表達在根治性前列腺切除術后復發(fā)風險更高。研究［12，41］表明：AR-V7 陽性PCa 患者樣本數量和AR-V7 mRNA 表達水平均隨著PCa 進展而增加，并且AR-V7 mRNA 高水平表達的患者手術后中位PFS 和中位OS 較短，AR-V7 表達與PCa 患者預后不良和復發(fā)有密切關聯。大量臨床證據提示：AR-V7 表達在CRPC 進展及PCa 耐藥性產生過程中具有重要作用。

7 小結及展望

隨著PCa 發(fā)病率和死亡率的逐年升高，PCa 已經嚴重威脅中老年男性的健康。AR 信號通路在PCa 發(fā)生發(fā)展過程中具有重要作用，即使治療初期ADT 可以在一定程度上緩解PCa 進展，但PCa 患者最終不可逆地發(fā)展為CRPC 以及產生耐藥性，嚴重阻礙了PCa 的治療效果。AR-V7 表達所導致的AR 信號通路異常激活，是促進CRPC 發(fā)展和產生耐藥性的關鍵因素之一，雖然具體機制目前尚未完全闡明，但揭示AR 和AR-V7 的交互調控機制及差異將會為PCa 的治療提供新的方向［31，33，42］。在今后的臨床實踐中可以通過檢測晚期PCa 患者AR-V7 mRNA 和蛋白表達水平，選擇個體化治療方案。同時，隨著臨床樣本量的擴大和細胞機制研究的深入，AR-V7 也可能作為預測PCa 進展以及對化療藥物敏感性的生物標志物［30，43-44］。