葛靜,謝磊,李林,魏旭靜,陳然,王娜

（河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院婦產(chǎn)科，河北 石家莊 050000）

子宮內(nèi)膜癌是常見的婦科惡性腫瘤，其發(fā)病率高，占女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤的25%～35%［1］。臨床上對子宮內(nèi)膜癌的治療手段主要有手術(shù)治療、孕激素治療和化學(xué)藥物治療等［2-4］，多數(shù)子宮內(nèi)膜癌患者經(jīng)過治療后預(yù)后良好，但仍有部分晚期患者出現(xiàn)復(fù)發(fā)，且復(fù)發(fā)患者預(yù)后較差［5］。研究［6］表明：子宮內(nèi)膜癌患者預(yù)后不良的主要原因是出現(xiàn)癌細胞侵襲和轉(zhuǎn)移。因此，對子宮內(nèi)膜癌細胞侵襲和轉(zhuǎn)移的生物學(xué)指標展開研究具有重要意義?；虬邢蛑委熓墙陙碛行е委煇盒阅[瘤的方法，具有靶向性強和不良反應(yīng)少的特點。整合素連接激酶（integrin-linked kinase，ILK）是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在多種惡性腫瘤組織中其表達水平均明顯升高，可通過多條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑參與腫瘤細胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移等生物行為過程［7-8］。目前，國內(nèi)外關(guān)于ILK 與子宮內(nèi)膜癌關(guān)系方面的研究較少。本研究旨在觀察ILK 在子宮內(nèi)膜癌組織和細胞中的表達情況，分析其對子宮內(nèi)膜癌細胞侵襲和轉(zhuǎn)移的影響及其可能的作用機制，為尋求抑制子宮內(nèi)膜癌細胞侵襲和轉(zhuǎn)移提供新靶點。

1 材料與方法

1.1 細胞、主要試劑和儀器人子宮內(nèi)膜癌HEC-1B 細胞購自中科院上海細胞庫。DMEM 培養(yǎng)基購自美國Sigma 公司，胰蛋白酶購自美國Gibco 公司，ILK siRNA 由武漢晶賽公司提供，免疫組織化學(xué)SP 試劑盒購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司，二喹啉甲酸（bicinchoninic acid disodium，BCA）蛋白定量試劑盒購自北京普利萊基因技術(shù)有限公司，鼠抗人ILK 單克隆抗體購自美國Santa Cruz 公司，兔抗人蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）和糖原合成酶激酶3β（glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β）多克隆抗體、磷酸化Akt（p-Akt）和磷酸化GSK-3β（p-GSK-3β）多克隆抗體及GAPDH多克隆抗體均購自美國Abcam 公司，辣根過氧化物酶標記羊抗兔IgG 購自北京中杉金橋公司。MM-800 型光學(xué)顯微鏡（日本尼康公司），DYCZ-24KS型雙板垂直電泳儀（北京六一生物科技有限公司）。

1.2 標本收集選取2018 年1 月－2019 年1 月本院收治的29 例手術(shù)切除子宮內(nèi)膜癌患者，所有患者病理診斷明確，術(shù)前均未接受過放化療或藥物干預(yù)治療，患者年齡35～74 歲，平均年齡（51.37 ±10.30）歲。取子宮內(nèi)膜癌組織和癌旁正常組織置于－80℃冰箱中保存。本研究經(jīng)本院倫理委員會批準，并取得患者知情同意。

1.3 免疫組織化學(xué)SP法檢測子宮內(nèi)膜癌細胞中ILK 陽性表達率取子宮內(nèi)膜癌組織和癌旁正常組織，采用免疫組織化學(xué)SP 法染色，嚴格按說明書操作。陽性判斷標準： 每張切片隨機取5 個視野計數(shù)100 個腫瘤細胞，按其著色強度與陽性細胞數(shù)評分并求均值。著色強度評分標準：無著色為0 分，淡黃色為1 分，棕黃色為2 分，棕褐色為3 分。陽性細胞百分率：無陽性細胞為0 分，0%＜陽性細胞數(shù)≤4%為1 分，4%＜陽性細胞數(shù)≤24% 為2 分，24%＜陽性細胞數(shù)≤49%為3 分，陽性細胞數(shù)＞49% 為4 分。以兩者得分乘積＞3 分為（+），表示該病例顯示陽性反應(yīng)。

1.4 細胞培養(yǎng)將子宮內(nèi)膜癌HEC-1B 細胞接種于含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液，于37℃、飽和濕度及5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當細胞密度達到80%時，用0.25%的胰蛋白酶消化傳代。細胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期后，胰蛋白酶消化，采用細胞培養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度為每毫升3 × 104個細胞，以每孔1 mL 接種于6 孔細胞培養(yǎng)板中，細胞生長至融合度為80%時，采用Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染細胞，分別作為干擾組和空載組，同時以轉(zhuǎn)染的細胞為對照組，轉(zhuǎn)染48 h。

1.5 Western blotting 法檢測HEC-1B 細胞中ILK、Akt、p-Akt、GSK-3β 和p-GSK-3β 蛋白表達水平用細胞裂解液裂解細胞20 min，12 000 r·min－1離心15 min，提取各組細胞總蛋白，BCA 法測定蛋白含量。酶標儀測定各組蛋白含量并配平，使各組蛋白終濃度為5 g·L-1。每個加樣孔加樣50 μg，采用SDS-PAGE 凝膠電泳分離蛋白，電泳，轉(zhuǎn)膜。于37℃封閉2 h，采用鼠抗人ILK 單克隆抗體（1 ∶300）和兔抗人Akt 多克隆抗體（1∶1 000）、p-Akt 多克隆抗體（1∶1 000）、GSK-3β 多克隆抗體（1∶1 000）、磷酸化的GSK-3β（p-GSK-3β）（1∶1 000）和GAPDH（1∶10 000），4℃孵育過夜，TBST 漂洗，37℃孵育山羊抗兔IgG（1∶10 000）二抗20 min，TBST 漂洗，ECL 試劑顯色，Bio-Rad 發(fā)光系統(tǒng)呈像，檢測分析條帶灰度值，目的蛋白相對表達水平＝目的蛋白條帶灰度值/ GAPDH條帶灰度值。

1.6 細胞劃痕實驗檢測細胞遷移距離干擾組、空載組和對照組細胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期后，以每毫升2 × 105個細胞鋪于6 孔細胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)過夜，待細胞完全貼壁后，吸除上清液，用200 μL 移液槍槍頭劃出細胞刮痕，用無血清培養(yǎng)基洗滌劃下的細胞。加入細胞培養(yǎng)液，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。在倒置顯微鏡下觀察0 和24 h 劃痕寬度，計算細胞遷移距離。細胞遷移距離＝0 h 劃痕寬度－24 h 劃痕寬度。

1.7 Transwell小室法檢測細胞侵襲數(shù)將基質(zhì)膠加入到24 孔Transwell 小室中，并將其小室置于37℃培養(yǎng)箱中濕化3 h，待基質(zhì)膠凝固后，加入不含胎牛血清的細胞培養(yǎng)液繼續(xù)孵育40 min。取細胞懸浮液加入小室的上室，在小室的下室加入750 μL含有胎牛血清的細胞培養(yǎng)液。培養(yǎng)24 h 后，取出小室，用棉簽將非入侵性細胞擦掉，采用甲醇和蘇木素染色將通過膜和黏膜下表面遷移的細胞固定。在顯微鏡下隨機選取6 個視野，觀察侵襲細胞數(shù)，以侵襲細胞數(shù)反映細胞侵襲能力。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。子宮內(nèi)膜癌和癌旁正常組織中ILK 陽性表達率以百分率（%）表示，2 組間百分率比較采用χ2檢驗。各組細胞中ILK、Akt、p-Akt、GSK-3β 和p-GSK-3β 蛋白表達水平，細胞遷移距離及侵襲細胞數(shù)均符合正態(tài)分布，以表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 子宮內(nèi)膜癌組織和癌旁正常組織中ILK 陽性表達率29 例子宮內(nèi)膜癌和癌旁正常組織中，23 例癌組織ILK 為（+），陽性表達率為79.3%；3 例癌旁正常組織ILK 為（+），陽性表達率為10.3%，ILK 在子宮內(nèi)膜癌組織中的陽性表達率明顯高于癌旁正常組織（P＜0.05）。

2.2 各組細胞中ILK 蛋白表達水平與對照組和空載組比較，干擾組細胞ILK 蛋白的表達水平明顯降低，約降低60%。見圖1。

圖1 各組細胞中ILK 蛋白表達電泳圖Fig.1 Electrophoregram of expressions of ILK protein in cells in various groups

2.3 各組細胞遷移距離和侵襲細胞數(shù)與對照組和空載組比較，干擾組細胞遷移距離明顯縮短（P＜0.05），表明干擾組細胞遷移能力明顯降低；與對照組和空載組比較，干擾組侵襲細胞數(shù)明顯減少（P＜0.05），表明干擾組細胞侵襲能力明顯降低。見表1、圖2 和圖3。

表1 各組細胞遷移距離和侵襲細胞數(shù)Tab.1 Migration distance of cells and number of invasion cells in various groups（n＝3,）

表1 各組細胞遷移距離和侵襲細胞數(shù)Tab.1 Migration distance of cells and number of invasion cells in various groups（n＝3,）

*P＜0.05vscontrol group；△P＜0.05vsempty vector group.

圖2 細胞劃痕實驗檢測各組細胞遷移情況（×100）Fig.2 Migration of cells in various groups detected by cell scratch test（×100）

2.4 各組細胞中Akt、p-Akt、GSK-3β 和p-GSK-3β蛋白表達水平與對照組和空載組比較，干擾組p-Akt 和p-GSK-3β 蛋白表達水平明顯降低（P＜0.05），Akt 和GSK-3β 蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表2 和圖4。

表2 各組細胞中Akt、p-Akt、GSK-3β 和p-GSK-3β 蛋白表達水平Tab.2 Expression levels of Akt,p-Akt,GSK-3β,and p-GSK-3β proteins in cells in various groups（n＝3,）

表2 各組細胞中Akt、p-Akt、GSK-3β 和p-GSK-3β 蛋白表達水平Tab.2 Expression levels of Akt,p-Akt,GSK-3β,and p-GSK-3β proteins in cells in various groups（n＝3,）

*P＜0.05vscontrol group；△P＜0.05vsempty vector group.

3 討論

ILK 是一種多功能的細胞內(nèi)信號蛋白，能協(xié)調(diào)細胞外基質(zhì)和生長因子的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，調(diào)控細胞的增殖、分化、遷移、侵襲和血管生成［9-11］。上皮-間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是導(dǎo)致子宮內(nèi)膜癌發(fā)生轉(zhuǎn)移的直接原因，ILK 蛋白作為EMT 調(diào)控蛋白，主要通過誘導(dǎo)腫瘤細胞的EMT 過程介導(dǎo)腫瘤細胞的遷移和侵襲［12］。研究［8，13-15］表明：ILK 蛋白在上皮性卵巢癌、子宮頸癌和胰腺癌等癌組織中過度表達，其患者預(yù)后差。本研究結(jié)果顯示：在子宮內(nèi)膜癌患者組織中ILK 蛋白陽性表達率明顯高于癌旁正常組織，與同類型研究［16］結(jié)果一致。

圖4 各組細胞中Akt、p-Akt、GSK-3β 和p-GSK-3β 蛋白表達電泳圖Fig.4 Electrophoregram of expressions of Akt，p-Akt，GSK-3β，and p-GSK-3β proteins in cells in various groups

Akt 是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，是PI3K/Akt通路中的主要活性物質(zhì)，參與血管形成、基因轉(zhuǎn)錄、細胞遷移和細胞周期調(diào)控等生物過程，與其下游調(diào)節(jié)因子GSK-3β 共同參與細胞凋亡過程。p-GSK-3β 可通過抑制促凋亡蛋白的蛋白線粒體轉(zhuǎn)位，從而抑制細胞凋亡，促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展［17］。研究［18-19］表明：ILK 能夠結(jié)合并磷酸化整合素β1亞單位，激活PIK3/Akt 信號通路，磷酸化Akt。p-Akt 能夠降低GSK-3β 活性，改變細胞周期，抑制細胞凋亡。本研究結(jié)果顯示：沉默ILK 基因后，p-Akt 和p-GSK3β 表達水平明顯降低，GSK-3β 的表達水平升高但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。本研究結(jié)果表明：抑制ILK 蛋白的表達能夠阻斷Akt/GSK-3β 信號通路相關(guān)蛋白磷酸化，調(diào)控細胞周期，促進細胞凋亡。另外，siRNA 沉默ILK 基因后子宮內(nèi)膜癌HEC-1B 細胞的遷移和侵襲能力明顯下降，與前期研究［20］結(jié)果一致，表明抑制ILK 表達能夠抑制腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移。

綜上所述，ILK 蛋白在子宮內(nèi)膜癌患者組織中呈高水平表達，抑制子宮內(nèi)膜癌HEC-1B 細胞中ILK 蛋白表達能夠抑制細胞的遷移和侵襲能力，其機制可能與通過調(diào)控Akt/GSK-3β 途徑抑制Akt 和GSK-3 磷酸化有關(guān)。本研究結(jié)果將為ILK 作為子宮內(nèi)膜癌新的抗腫瘤治療靶基因提供實驗依據(jù)。