喬良偉,曲青山,李明

（鄭州人民醫(yī)院器官移植中心腎臟移植科，河南 鄭州 450000）

腎移植是治療終末期腎?。╡nd-stage kidney disease，ESRD）的有效手段，排斥反應(yīng)是腎移植術(shù)后的主要難題和并發(fā)癥，也是影響移植腎長期存活的主要危險因素，目前臨床上最常見的排斥反應(yīng)類型是急性排斥反應(yīng)（acute rejection，AR）［1］。近年來，隨著免疫抑制劑的出現(xiàn)，腎移植后排斥反應(yīng)發(fā)生率不斷下降，但仍時有發(fā)生。長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，LncRNA）是一類不具有蛋白編碼功能的RNA，廣泛參與調(diào)節(jié)機體的各項基礎(chǔ)生物進程，其表達水平異常與多種疾病的發(fā)生發(fā)展存在密切關(guān)聯(lián)［2］。被轉(zhuǎn)化生長因子β 活化的長鏈非編碼 RNA（long non-coding RNA activated by TGF-β，LncRNA-ATB）是LncRNAs的重要成員，參與細胞增殖、凋亡、轉(zhuǎn)移和侵襲等多種生理過程［3］。既往研究［4］表明：LncRNAATB 在器官移植免疫排斥反應(yīng)中起調(diào)控作用，但在腎移植方面報道較少。本研究通過沉默腎移植模型大鼠LncRNA-ATB 的表達，探討LncRNA-ATB對腎移植大鼠移植后AR 和受體組織炎癥反應(yīng)的影響，分析腎移植AR 潛在的分子機制，為臨床診斷和治療AR 提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、主要試劑和儀器供體：雄性SD大鼠30只，SPF級，7～8 周齡，體質(zhì)量250～300 g；受體：雄性Wistar 大鼠40 只，SPF 級，7～8 周齡，體質(zhì)量230～300 g；均由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2016-0001。所有大鼠術(shù)前12h禁食不禁水。含有LncRNA-ATB-短發(fā)夾（shRNA）和LncRNA-ATB-NC 的psiCHECK2 基因重組質(zhì)粒（上海吉瑪公司），Opti-MEM 培養(yǎng)基和脂質(zhì)體 2000（Lipofectamine 2000）（美國Invitrogen公司），白細胞介素6（interleukin6，IL-6）、白細胞介素8（interleukin-8，IL-8）和腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）ELISA 試劑盒（美國Abcam公司），兔抗大鼠Toll 樣受體4（Toll-like receptor-4，TLR4）、髓樣細胞分化因子88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）和核轉(zhuǎn)錄因子 κB（nuclear transcription factor κB，NF-κB）多抗及辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔MyD88 和NF-κB單抗（英國Abcam公司）。7600 全自動生化分析儀（日本Hitachi 公司），Cary3500 紫外分光光度計（美國安捷倫公司），550 型全自動酶標儀和PowerPac 系列電泳儀（美國Bio-Rad 公司）。

1.2 大鼠腎移植AR 模型建立和分組供體和受體大鼠腹腔注射水合氯醛溶液（10%W/V）進行麻醉，固定于手術(shù)臺上。供體30 只SD 大鼠經(jīng)中線切口暴露腹主動脈、左腎及其所屬動靜脈，結(jié)扎腎上腺動靜脈，游離左腎及腎動靜脈，分離輸尿管，用4℃含肝素生理鹽水灌注左腎阻斷腎臟血液供應(yīng)，切斷左腎靜脈，待左腎顏色變?yōu)辄S白色且左腎靜脈流出清亮的灌注液后，切斷左腎動脈，取出腎臟保存于4℃含肝素生理鹽水中，剪去供腎多余脂肪及腔靜脈，以利血管吻合。受體30 只Wistar 大鼠暴露左腎后移除，將供腎放置左腎窩，左腎靜脈采用cuff 套管吻合法，動脈采用端端吻合法。吻合完成后打開血管夾，數(shù)秒內(nèi)可見左腎顏色變紅，少量尿液從輸尿管排出。術(shù)后肌肉注射青霉素10 萬單位，連續(xù)3 d。其余10 只Wistar 大鼠為假手術(shù)組，開腹后隨即連續(xù)全層關(guān)閉，其他操作同上。術(shù)后所有大鼠均給予正常飲食和飲水。術(shù)后將移植成功的27 只大鼠（死亡3 只）隨機分為模型組、LncRNA-ATB-shRNA 組和LncRNA-ATB-NC 組，每組9 只。

1.3 干預(yù)方法制備質(zhì)粒脂質(zhì)體復(fù)合物：按照Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑盒說明書，將5 μg 含有LncRNA-ATB-shRNA（或LncRNA-ATB-NC）的 psiCHECK2 基因重組質(zhì)粒、10μL Lipofectamine 2000 分別用Opti-MEM 培養(yǎng)基稀釋至總體積各為30 μL，室溫靜置5 min，然后將2 種液體混合均勻，室溫放置30 min，獲得質(zhì)粒脂質(zhì)體復(fù)合物備用。腎移植術(shù)后2 h 分別將2 種質(zhì)粒脂質(zhì)體復(fù)合物用Opti-MEM 培養(yǎng)基稀釋至總體積200 μL，經(jīng)尾靜脈分別快速注入LncRNA-ATBshRNA 組和LncRNA-ATB-NC 組大鼠體內(nèi)。假手術(shù)組和模型組大鼠按每只200 μL 尾靜脈注射Opti-MEM 培養(yǎng)基。

1.4 RT-PCR 法檢測大鼠外周血中LncRNAATB、微小RNA（microRNA，miRNA）-200c 表達水平各組大鼠干預(yù)7 d 后，腹主動脈采血2 mL 放入抗凝管中，按照TRIzol 說明書提取總RNA，應(yīng)用紫外分光光度計測定RNA 純度和濃度，將提取的總RNA 按試劑盒說明書進行逆轉(zhuǎn)錄得到相對應(yīng)的cDNA，進行產(chǎn)物擴增。以cDNA 為模板，配制反應(yīng)體系：SYBR GREEN MasterMix 10 μL，上游引物0.5 μL，下游引物0.5 μL，模板cDNA 1 μL，加雙蒸水至總體積20 μL。反應(yīng)條件：預(yù)變性94℃、10 min；變性94℃、10 s，退火60℃、30 s，延伸70℃、20 s，35 個循環(huán)，每個樣本檢測3 次，取平均數(shù)。引物均由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司設(shè)計合成，LncRNA-ATB 以β-actin 為內(nèi)參，miR-200c 以U6 為內(nèi)參，采用2－△△Ct法計算LncRNA-ATB 和miR-200c 表達水平。引物序列見表1。

1.5 全自動生化分析儀檢測各組大鼠血肌酐（serum creatinine，Scr）和血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）水平各組大鼠腹主動脈采血，離心半徑12cm，3 000 r·min－1離心20 min，取上清-20℃冰箱保存。采用全自動生化分析儀檢測大鼠血清中Scr 和BUN 水平。

表1 LncRNA-ATB 和miR-200c PCR 擴增引物序列Tab.1 Sequences of LncRNA-ATB,miR-200c PCR amplification primer

1.6 酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）法檢測各組大鼠血清中IL-6、IL-8 和TNF-α 水平取保存血清，嚴格按照ELISA 試劑盒說明書操作步驟，檢測大鼠血清中IL-6、IL-8 和TNF-α水平，用酶標儀在490 nm波長處測量吸光度（A）值，以標準品濃度和A 值繪制標準曲線，分別根據(jù)公式Y(jié) ＝0.970 1X+0.011 8、Y ＝1.025 3X－0.001 7 和Y ＝0.974 6X+0.011 4 計算待測樣品IL-6、IL-8 和TNF-α 水平。

1.7 各組大鼠腎組織病理學(xué)觀察及AR 分級采血完畢，處死各組大鼠，無菌摘取左腎并切分成兩半，一半置于體積分數(shù)為10%中性甲醛保存?zhèn)溆?。取中性甲醛中保存的腎組織，常規(guī)石蠟包埋、切片、蘇木精-伊紅（HE）染色，置于光鏡下觀察大鼠腎組織病理形態(tài)表現(xiàn)。AR 的診斷參照Banff 2007 移植腎病理學(xué)分類標準［5］，按照嚴重程度分為7 級：正常、臨界性改變、Ⅰa 級、Ⅰb 級、Ⅱa 級、Ⅱb 級和Ⅲ級。AR 分級半定量評分：正常為0 分，臨界性改變?yōu)? 分，Ⅰa 為2 分，Ⅰb 級為3 分，Ⅱa 級為4 分，Ⅱb 級為5 分，Ⅲ級為6 分。

1.8 RT-PCR 法檢測各組大鼠腎組織中TLR4、MyD88 中NF-κB mRNA 表達水平采血完畢，處死大鼠，無菌摘取左腎并切分成兩半，一半置于液氮中保存?zhèn)溆?。取液氮中保存的腎組織100 mg，按照TRIzol 試劑盒說明書提取總RNA，測定RNA純度和濃度后進行cDNA 逆轉(zhuǎn)錄，配制20 μL 反應(yīng)體系：模板cDNA 2 μL，上下游引物各2 μL，Taq DNA 聚合酶10 μL，雙蒸水6 μL。以轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA 為模板，以β-actin 為內(nèi)參，進行PCR 擴增。擴增條件：預(yù)變性95℃、10 min，變性95℃、60 s，退火55℃、30 s，延伸65℃、30 s，共40 個循環(huán)。各組大鼠腎組織中TLR4、MyD88 和NF-κB mRNA 表達水平按2－ΔΔCt法計算。引物序列見表2。

表2 PCR 擴增引物序列Tab.2 Sequences of PCR amplification primers

1.9 Western blotting 法檢測各組大鼠腎組織中TLR4、MyD88 和NF-κB 蛋白表達水平取液氮保存的腎組織100 mg，在液氮中研磨后離心取上清，BCA 試劑盒檢測蛋白濃度，制備蛋白樣品，蛋白上樣進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰氨（SDSPAGE）凝膠電泳，電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜，5%脫脂牛奶孵育2 h，加入稀釋的一抗 TLR4（1 ∶1 000），MyD88（1 ∶1 000）、NF-κ B（1 ∶1 000）和β-actin（1∶1 000），4℃搖床封閉過夜，洗膜后加入稀釋的二抗（1∶4 000）于室溫下?lián)u床孵育1 h，洗膜后加入ELC 試劑顯影，暗室下曝光成像。采用Image J 軟件分析圖像，計算TLR4、MyD88 和NF-κB 蛋白表達水平。目的蛋白表達水平＝目的蛋白條帶灰度值/β-actin 蛋白條帶灰度值。

1.10 統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 21.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。采用KS 檢驗數(shù)據(jù)正態(tài)分布，各組大鼠外周血中LncRNA-ATB 和miR-200c 表達水平，血清中Scr、BUN，IL-6、IL-8 和TNF-α 水平，腎組織中TLR4、MyD88 和NF-κB mRNA 及蛋白表達水平均符合正態(tài)分布，以表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩兩組間樣本均數(shù)比較采用SNK-q檢驗。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠外周血中LncRNA-ATB 和miR-200c 表達水平各組大鼠外周血中LncRNA-ATB和miR-200c 表達水平組間比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。與假手術(shù)組比較，模型組、LncRNA-ATB-NC 組和LncRNA-ATB-shRNA 組大鼠外周血中LncRNA-ATB 表達水平均升高（P＜0.05），miR-200c 表達水平均降低（P＜0.05）；與模型組和LncRNA-ATB-NC 組比較，LncRNA-ATB-shRNA 組LncRNA-ATB 表達水平降低（P＜0.05），miR-200c 表達水平升高（P＜0.05）；模型組與LncRNA-ATB-NC 組大鼠外周血中LncRNA-ATB 和miR-200c 表達水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表3。

2.2 各組大鼠血清中Scr、BUN、IL-6、IL-8 和TNF-α 水平各組大鼠血清中Scr、BUN、IL-6、IL-8 和TNF-α 水平組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。與假手術(shù)組比較，模型組、LncRNAATB-NC 組和LncRNA-ATB-shRNA 組大鼠血清中Scr、BUN、IL-6、IL-8 和TNF-α 水平均升高（P＜0.05）；與模型組和LncRNA-ATB-NC 組比較，LncRNA-ATB-shRNA 組大鼠血清中Scr、BUN、IL-6、IL-8 和TNF-α水平均降低（P＜0.05）；模型組與LncRNA-ATB-NC 組大鼠血清中Scr、BUN、IL-6、IL-8 和TNF-α 水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表4。

表3 各組大鼠外周血中LncRNA-ATB 和miR-200c mRNA表達水平Tab.3 Expression levels of LncRNA-ATB and miR-200c mRNA in peripheral blood of rats in various groups（）

表3 各組大鼠外周血中LncRNA-ATB 和miR-200c mRNA表達水平Tab.3 Expression levels of LncRNA-ATB and miR-200c mRNA in peripheral blood of rats in various groups（）

*P＜0.05 compared with sham operation group ；△P＜0.05 compared with model group；#P＜0.05 compared with LncRNA-ATB-NC group.

2.3 HE 染色觀察各組大鼠腎組織病理形態(tài)表現(xiàn)和AR 分級半定量評分HE染色，假手術(shù)組大鼠腎組織無AR，結(jié)構(gòu)清楚；模型組大鼠出現(xiàn)典型AR，表現(xiàn)為炎性細胞浸潤、動脈炎癥、間質(zhì)細胞水腫和皮質(zhì)出血等；LncRNA-ATB-NC 組與模型組腎組織病理形態(tài)表現(xiàn)相似；LncRNA-ATBshRNA 組大鼠腎組織病理形態(tài)表現(xiàn)較模型組和LncRNA-ATB-NC 組均減輕。假手術(shù)組、模型組、LncRNA-ATB-NC 組和LncRNA-ATB-shRNA 組的AR 分級半定量評分分別為（0.00±0.00）分、（4.26±0.44）分、（4.54±0.45）分和（1.75±0.18）分。AR 分級半定量評分組間比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（F＝425.923，P＜0.05）。與假手術(shù)組比較，模型組、LncRNA-ATB-NC 組和LncRNA-ATB-shRNA 組的AR 分級半定量評分均升高（P＜0.05）；與模型組和LncRNA-ATB-NC組比較，LncRNA-ATB-shRNA 組的AR 分級半定量評分降低（P＜0.05）；模型組與LncRNA-ATBNC 組的AR 分級半定量評分比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖1。

表4 各組大鼠血清中Scr、BUN、IL-6、IL-8 和TNF-α 水平Tab.4 Levels of Scr,BUN,IL-6,IL-8,and TNF-α in serum of rats in various groups（）

表4 各組大鼠血清中Scr、BUN、IL-6、IL-8 和TNF-α 水平Tab.4 Levels of Scr,BUN,IL-6,IL-8,and TNF-α in serum of rats in various groups（）

*P＜0.05 compared with sham operation group ；△P＜0.05 compared with model group；#P＜0.05 compared with LncRNA-ATB-NC group .

2.4 各組大鼠腎組織中TLR4、MyD88 和NF-κB mRNA 表達水平各組大鼠腎組織中TLR4、MyD88 和NF-κB mRNA 相對表達水平組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。與假手術(shù)組比較，模型組、LncRNA-ATB-NC 組和LncRNA-ATBshRNA 組大鼠腎組織中TLR4、MyD88 和NF-κB mRNA 表達水平均升高（P＜0.05）；與模型組和LncRNA-ATB-NC 組比較，LncRNA-ATB-shRNA組大鼠腎組織中TLR4、MyD88 和NF-κB mRNA表達水平均降低（P＜0.05）；模型組與LncRNAATB-NC 組大鼠腎組織中TLR4、MyD88 和NF-κB mRNA 表達水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表5。

表5 各組大鼠腎組織中TLR4、MyD88 和NF-κB mRNA 表達水平Tab.5 Expression levels of TLR4,MyD88 and NF-κB mRNA in kidney tissue of rats in various groups（）

表5 各組大鼠腎組織中TLR4、MyD88 和NF-κB mRNA 表達水平Tab.5 Expression levels of TLR4,MyD88 and NF-κB mRNA in kidney tissue of rats in various groups（）

*P＜0.05 compared with sham operation group；△P＜0.05 compared with model group；#P＜0.05 compared with LncRNA-ATB-NC group.

2.5 各組大鼠腎組織中TLR4、MyD88 和NF-κB蛋白表達水平各組大鼠腎組織中TLR4、MyD88 和NF-κB 蛋白表達水平組間比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。與假手術(shù)組比較，模型組、LncRNA-ATB-NC組和LncRNA-ATBshRNA組大鼠腎組織中TLR4、MyD88 和NF-κB蛋白表達水平均升高（P＜0.05）；與模型組和LncRNA-ATB-NC 組比較，LncRNA-ATB-shRNA組大鼠腎組織中TLR4、MyD88 和NF-κB 蛋白表達水平均降低（P＜0.05）；模型組與LncRNAATB-NC組大鼠腎組織中TLR4、MyD88 和NF-κB 蛋白表達水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表6 和圖2。

表6 各組大鼠腎組織中TLR4、MyD88 和NF-κB 蛋白表達水平Tab.6 Expression levels of TLR4,MyD88,and NF-κB proteins in kidney tissue of rats in various groups（）

表6 各組大鼠腎組織中TLR4、MyD88 和NF-κB 蛋白表達水平Tab.6 Expression levels of TLR4,MyD88,and NF-κB proteins in kidney tissue of rats in various groups（）

*P＜0.05 compared with sham operation group；△P＜0.05 compared with model group；#P＜0.05 compared with LncRNA-ATB-NC group.

3 討論

圖2 各組大鼠腎組織中NF-κB、MyD88 和TLR4 蛋白表達電泳圖Fig.2 Electrophoregram of expressions of NF-κB，MyD88，and TLR4 proteins in kidney tissue of rats in various groups

ERSD 是全球范圍內(nèi)重大公共衛(wèi)生問題，隨著腎移植的逐漸推廣，部分患者得到了有效治療，但術(shù)后AR 仍然是一個不可忽視的問題，其不僅是造成移植腎失功的危險因素，同時也嚴重影響移植腎的長期存活。隨著免疫抑制劑的不斷出現(xiàn)和改進，器官移植排斥反應(yīng)發(fā)生率明顯下降，但大量使用免疫抑制劑會給患者帶來不良反應(yīng)［6］。因此，探討移植免疫相關(guān)的分子機制對腎移植AR 早期診斷和治療具有重要意義。LncRNA 和miRNA 是最重要的2 類非編碼RNA，均在基因表達調(diào)控中起著關(guān)鍵作用。多項研究［7-9］表明：器官移植后LncRNA 在免疫排斥受體體內(nèi)異常表達，可以利用LncRNA 作為早期診斷受體對同種異體移植物產(chǎn)生AR 的標志物。既往研究［10-12］表明：LncRNA 可作為內(nèi)源競爭性RNA（competing endogenous RNA，ceRNA）與miRNA 直接結(jié)合，從而抑制miRNA 的活性，調(diào)控下游信號通路，進而影響疾病發(fā)展。研究［13］顯示：LncRNA-ATB 與miR-200s 也存在上述相互作用，LncRNA-ATB 可以與miR-200s 結(jié)合，抑制miR-200s 的表達，促進細胞增殖、遷移和侵襲。

本研究采用同種異體大鼠建立腎移植AR 模型，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠外周血LncRNA-ATB 表達水平明顯升高，表現(xiàn)出AR 典型病理變化，經(jīng)shRNA 干擾載體沉默LncRNAATB 后，LncRNA-ATB-shRNA 組大鼠外周血中LncRNA-ATB 表達水平、AR 半定量評分及血清中Scr 和BUN 水平明顯降低，腎組織AR 病理形態(tài)改變減輕，提示腎移植AR 大鼠LncRNA-ATB 異常升高，可能參與AR 發(fā)生發(fā)展過程，沉默LncRNAATB 后可減弱腎移植后AR 的發(fā)展。研究［14］表明：在腎移植術(shù)后AR 受體腎組織切片中LncRNAATB 表達水平明顯高于對照組，促進供體器官炎癥反應(yīng)。QIU 等［15］在對腎移植AR 患者和對照腎移植患者的腎臟活檢組織中檢測到LncRNA-ATB表達，AR 患者LncRNA-ATB 表達水平較對照組明顯上調(diào)，與本研究結(jié)果類似，進一步提示LncRNA-ATB 可能參與大鼠腎移植術(shù)后AR 進展，沉默LncRNA-ATB 有利于減弱AR 發(fā)展，減輕腎功能損害。

本研究結(jié)果顯示：與模型組比較，LncRNAATB-shRNA 組大鼠外周血中miR-200c 表達水平明顯升高，提示LncRNA-ATB 可能參與調(diào)控miR-200c 在腎移植大鼠中的表達。劉易［16］研究發(fā)現(xiàn)：LncRNA-ATB 參與調(diào)控 miR-200c 的表達，LncRNA-ATB 可以作為ceRNA 競爭性結(jié)合miR-200c 促進肺上皮細胞纖維化。趙偉等［17］研究顯示：LncRNA-ATB 與miR-200c 競爭性地調(diào)控其下游通路發(fā)揮對miR-200c 的調(diào)控作用。本研究與上述研究結(jié)果一致，表明LncRNA-ATB 與miR-200c在疾病發(fā)生發(fā)展過程中有關(guān)聯(lián)。miR-200c 是一種能夠抑制炎癥反應(yīng)的miRNA，與TLR4 信號通路關(guān)系密切。TLR4 信號通路與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，在依賴MyD88 途徑中，通過活化的結(jié)構(gòu)域與MyD88 結(jié)合，釋放NF-κB，活化下游炎癥因子（IL-6、IL-8 和TNF-α 等），促進炎癥反應(yīng)。過表達miR-200c 可抑制TLR4 信號通路，下調(diào)MyD88 表達，阻斷NF-κB 活化，降低IL-6 和TNF-α 表達［18］。既往研究［19］顯示：miR-200c 可以通過改變NF-κB 活性來調(diào)節(jié)IL-8 表達，過表達miR-200c 可以降低IL-8 表達。在口腔鱗狀細胞癌中，NF-κB激活的同時伴有促炎miRNA 表達水平升高及miR-200c 表達抑制［20］。本研究中經(jīng)shRNA 干擾載體沉默LncRNA-ATB 后，大鼠外周血中miR-200c表達水平明顯升高，IL-6、IL-8 和TNF-α 水平，TLR4、MyD88 和NF-κB mRNA 及蛋白表達水平均降低，提示沉默LncRNA-ATB 可能通過上調(diào)miR-200c 表達抑制TLR4/MyD88 信號通路發(fā)揮抗炎作用。

綜上所述，在大鼠腎移植后，沉默LncRNAATB 可發(fā)揮抑制AR 及炎癥反應(yīng)發(fā)生作用，其機制可能是通過上調(diào)miR-200c表達，阻斷下游TLR4/MyD88 信號通路，進而減弱AR 發(fā)展，抑制受體組織炎癥反應(yīng)，本研究結(jié)果為臨床早期診斷和治療腎移植術(shù)后AR 提供一定理論依據(jù)。