王明月,王浩,王冬梅,楊澤斌,崔梅英,劉寧,黃莉莉,關(guān)新剛

（北華大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院腫瘤靶向治療重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 吉林 132013）

信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白α（signal regulatory protein-α，SIRPα），也被稱為CD172a 或SHPS-1，是屬于免疫球蛋白超家族中的一種膜蛋白，是一種在巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和中性粒細(xì)胞等髓系細(xì)胞上表達(dá)的抑制性受體分子［1］。CD47 是SIRPα 的天然配體，在多種生理病理過程中均發(fā)揮作用［2-4］。正常的血液系統(tǒng)細(xì)胞表面均有CD47 表達(dá)，CD47-SIRPα 通路在紅細(xì)胞老化吞噬過程中發(fā)揮作用［5］。SIRPα 作為巨噬細(xì)胞上的關(guān)鍵免疫抑制受體，與SIRPα 配體CD47 的相互作用可阻止自體吞噬作用，因此可以利用CD47 與SIRPα 識(shí)別抑制巨噬細(xì)胞的吞噬作用和移植排斥反應(yīng)［6-7］。SIRPα 除在巨噬細(xì)胞表面表達(dá)外，還在中性粒細(xì)胞的表面呈高水平表達(dá)，多種腫瘤中CD47 分子呈高水平表達(dá)，巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞表面的SIRPα 與其識(shí)別結(jié)合后，會(huì)介導(dǎo)免疫抑制，發(fā)生免疫逃逸，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)展［8-9］。CD47-SIRPα 信號(hào)通路為腫瘤治療提供了新的思路，通過阻斷CD47-SIRPα 信號(hào)通路激活吞噬細(xì)胞對(duì)腫瘤的吞噬，增強(qiáng)腫瘤抗原遞呈，引發(fā)機(jī)體抗腫瘤免疫反應(yīng)，殺傷腫瘤細(xì)胞［10-11］。本研究通過構(gòu)建融合表達(dá)綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）的SIRPα 真核表達(dá)載體，制備穩(wěn)定表達(dá)SIRPα-GFP 的HEK293T 細(xì)胞系，并研究SIRPα-GFP 在細(xì)胞中的表達(dá)定位，為后續(xù)SIRPα的功能研究以及CD47-SIRPα 信號(hào)通路阻斷研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、主要試劑和儀器HEK293T 細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室凍存。培養(yǎng)基購自美國Hyclone 公司，胎牛血清購自杭州四季青公司，pLenti-C-mGFP 質(zhì)粒和pCMV6-SIRPα 質(zhì)粒購自美國Origene 公司，MluⅠ和SgfⅠ限制性內(nèi)切酶購自日本TaKaRa 公司，T4 DNA 連接酶購自上海碧云天生物技術(shù)公司，DH5α 感受態(tài)細(xì)胞和卡那霉素購自生工生物工程（上海）股份有限公司，質(zhì)粒提取試劑盒和凝膠回收試劑盒購自美國Axyprep 公司，Lipofectamine 3000 轉(zhuǎn)染試劑購自美國Invitrogen 公司，單克隆SIRPα 抗體購自美國Biolegend 公司，蛋白預(yù)染Marker、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG（H+L）和顯色底物購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。核酸電泳系統(tǒng)、凝膠成像系統(tǒng)、蛋白電泳和轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)均購自美國Bio-Rad 公司，倒置熒光顯微鏡購自美國Lifte-Technologies 公司，全自動(dòng)多功能酶標(biāo)儀購自瑞士TECAN 公司。

1.2 SIRPα 真核表達(dá)載體的構(gòu)建和鑒定將測序正確的pLenti-C-mGFP 質(zhì)粒與pCMV6-SIRPα 質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶MluⅠ和SgfⅠ進(jìn)行雙酶切：各取2 μ g 質(zhì)粒，加入1 μ L 限制性內(nèi)切酶MluⅠ和SgfⅠ，37℃水浴4 h，酶切產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳分離并對(duì)相關(guān)片段進(jìn)行凝膠回收，利用T4 DNA 快速連接酶在25℃水浴連接1 h，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，接種到含有卡那霉素的LB 平板培養(yǎng)基中，過夜培養(yǎng)。從平板培養(yǎng)基中挑取單個(gè)菌落，160 r·min-1搖床過夜，提取質(zhì)粒后用MluⅠ和SgfⅠ限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切，在0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測雙酶切后DNA 片段大小。雙酶切驗(yàn)證成功的質(zhì)粒DNA 送到生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行DNA 測序分析。

1.3 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293T 細(xì)胞HEK293T 細(xì)胞在含有10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基中，置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前1 d，將對(duì)數(shù)生長期的HEK293T 細(xì)胞以每孔1×106個(gè)細(xì)胞接種于6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，使細(xì)胞在第2 天達(dá)到70%～80% 融合度。第2 天，從培養(yǎng)箱中取出6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)的HEK293T 細(xì)胞，吸除原有培養(yǎng)基，加入2 mL PBS 緩沖液清洗細(xì)胞2 次后，換為Opti-MEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)。利用Lipofectamine 3000 轉(zhuǎn)染試劑，將2 μg 質(zhì)粒DNA 以及10 μL 轉(zhuǎn)染試劑分別與125 μL Opti-MEM 培養(yǎng)基混勻，之后將帶有質(zhì)粒DNA 的混合物加入到帶有轉(zhuǎn)染試劑的試管中，混勻后室溫靜置15 min，加入到6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板HEK293T 細(xì)胞培養(yǎng)基中。轉(zhuǎn)染48 h 后在熒光顯微鏡下488 nm 激發(fā)光觀察SIRPα-GFP 綠色熒光的表達(dá)及細(xì)胞膜定位情況。

1.4 Western blotting 法檢測HEK293T 細(xì)胞中SIRPα-GFP 融合蛋白的表達(dá)為了對(duì)轉(zhuǎn)染后的HEK293T 細(xì)胞進(jìn)行篩選，轉(zhuǎn)染48 h 后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到10cm 培養(yǎng)皿進(jìn)行培養(yǎng)，使細(xì)胞在24 h 后達(dá)到40%～50% 的融合度，更換為含有嘌呤霉素（8 mg·L－1）的新鮮培養(yǎng)基，每隔2 d 棄去原有培養(yǎng)基，用PBS 緩沖液清洗2 遍，更換含有嘌呤霉素（8 mg·L－1）的新鮮培養(yǎng)基，此步驟重復(fù)3 次。已經(jīng)篩選后的細(xì)胞，擴(kuò)大培養(yǎng)后收集細(xì)胞，PBS 緩沖液清洗2～3 次，用RIPA 裂解液冰上裂解60 min，每隔10 min 顛倒混勻，之后將裂解物經(jīng)12 000 g、4℃離心30 min，留取上清進(jìn)行蛋白定量以及Western blotting 法驗(yàn)證。取30 μg 總蛋白經(jīng)12%SDS-PAGE 凝膠分離，25 V 恒壓14 min 轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上。PVDF 膜用含有5% 脫脂奶粉的TBST 封閉液室溫封閉2 h，與稀釋后的SIRPα 一抗（1∶1 000 稀釋）和Actin 一抗（1∶1 000 稀釋）在4℃搖床孵育過夜。過夜后的PVDF 膜用TBST 清洗3 次，每次10 min，再與羊抗鼠二抗（1∶1 000 稀釋）室溫孵育2 h，經(jīng)TBST 洗膜3 次，每次10 min。將膜放置于顯影儀曝光板上，將特超敏ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒（BeyoECL Star）中的A 液和B 液按1∶1 比例混合，覆蓋到膜上，曝光30 s，拍攝圖像，若在相對(duì)分子質(zhì)量為83 000附近出現(xiàn)清晰條帶則提示SIRPα-GFP 融合蛋白表達(dá)成功。

2 結(jié)果

2.1 SIRPα-GFP 真核表達(dá)載體的構(gòu)建本研究利用現(xiàn)有的慢病毒質(zhì)粒pLenti-C-mGFP 作為真核表達(dá)載體進(jìn)行重組質(zhì)粒構(gòu)建。將表達(dá)載體pLenti-CmGFP與SIRPα質(zhì)粒（pCMV6-SIRPα）用限制性內(nèi)切酶MluⅠ和SgfⅠ雙酶切后，酶切產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳分離，pLenti-C-mGFP 質(zhì)粒雙酶切后可見長度約為756 bp 的片段，pCMV6-SIRPα 質(zhì)粒雙酶切后可見長度約為1 527 bp 的片段（圖1）。目的片段凝膠回收后，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Kana 平板，陽性菌落在進(jìn)行質(zhì)粒提取后通過MluⅠ和SgfⅠ雙酶切鑒定，電泳結(jié)果顯示：重組質(zhì)粒雙酶切后可見約為7800和1 500bp的2個(gè)DNA條帶，與pLenti-C-mGFP 載體及SIRPα 基因大小相符（圖2），提示重組質(zhì)粒pLenti-SIRPα-GFP 構(gòu)建成功。

圖1 GFP 表達(dá)載體（pLenti-C-mGFP）和SIRP α 質(zhì)粒（pCMV6-SIRPα）雙酶切結(jié)果Fig.1 Double digestion results of GFP expression vector（pLenti-C-mGFP）and SIRPα plasmid（pCMV6-SIRPα）

圖2 重組質(zhì)粒pLenti-SIRPα-GFP 的雙酶切鑒定Fig.2 Identification of recombinant plasmid pLenti-SIRPα-GFP by double digestion

2.2 真核表達(dá)載體的DNA 序列測定將重組質(zhì)粒pLenti-SIRPα-GFP 進(jìn)行DNA 序列測定分析，測序結(jié)果顯示：SIRPα 基因成功插入到pLenti-C-mGFP載體中的SgfⅠ位點(diǎn)（GCGATCGCC），提示SIRPα-GFP 重組質(zhì)粒pLenti-SIRPα-GFP 構(gòu)建成功（圖3）。

2.3 SIRPα-GFP 重組質(zhì)粒的真核表達(dá)通過Lipofectamine 3000 轉(zhuǎn)染試劑將重組質(zhì)粒pLenti-SIRPα-GFP 轉(zhuǎn)染HEK293T 細(xì)胞，48 h 后在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光。綠色熒光清晰地表達(dá)在轉(zhuǎn)染后的HEK293T 細(xì)胞膜上，與文獻(xiàn)［9］報(bào)道的SIRPα蛋白的膜定位一致。見圖4。

2.4 Western blotting 法檢測SIRPα 蛋白表達(dá)轉(zhuǎn)染空載體pLenti-C-mGFP 的HEK293T 細(xì)胞及轉(zhuǎn)染pLenti-SIRPα-GFP 后的HEK293T 細(xì)胞裂解后，采用Western blotting 法檢測HEK293T 細(xì)胞中SIRPα蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染pLenti-SIRPα-GFP質(zhì)粒的HEK293T 細(xì)胞裂解液在相對(duì)分子質(zhì)量為83 000 附近出現(xiàn)清晰的條帶，轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的HEK293T 細(xì)胞裂解液則未檢測出，考慮到SIRPα和GFP 蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量分別為56 000 及27 000，提示利用SIRPα 抗體檢測的特異性條帶為SIRPα-GFP融合蛋白。Western blotting 法檢測結(jié)果表明：SIRPα-GFP 融合蛋白在HEK293T 細(xì)胞中成功表達(dá)。見圖5。

圖5 Western blotting 法檢測HEK293T 細(xì)胞中SIRPα-GFP 蛋白表達(dá)電泳圖Fig.5 Electrophoregram of expression of SIRP α -GFP protein in HEK293T cells detected by Western blotting method

3 討論

腫瘤細(xì)胞通過表達(dá)與免疫細(xì)胞表面受體相互作用的活化或抑制性配體來逃避免疫監(jiān)視［12］。腫瘤與免疫細(xì)胞之間的相互作用可防止腫瘤被免疫系統(tǒng)殺傷，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖［13-14］。腫瘤細(xì)胞通過過度表達(dá)的CD47 分子識(shí)別免疫細(xì)胞表面表達(dá)的SIRPα分子，使腫瘤能夠逃避免疫系統(tǒng)監(jiān)視，因此CD47-SIRPα 信號(hào)通路在腫瘤治療等方面作用的研究受到越來越多的關(guān)注［15-16］。SIRPα是SIRP家族中一個(gè)典型的抑制性受體，在巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞和神經(jīng)元上具有高水平的表達(dá)，研究［17］表明：SIRPα 在生理和病理過程中均發(fā)揮重要作用。SIRPα 代表一種髓樣特異性免疫檢查點(diǎn)，與腫瘤細(xì)胞表面高表達(dá)的“不要吃我”信號(hào)CD47 結(jié)合，會(huì)抑制免疫系統(tǒng)對(duì)腫瘤細(xì)胞的攻擊［18］。因此阻斷SIRPα 與CD47 的識(shí)別，會(huì)切斷CD47-SIRPα信號(hào)通路對(duì)免疫系統(tǒng)的抑制，恢復(fù)免疫細(xì)胞的吞噬殺傷作用，達(dá)到治療腫瘤的目的［19-20］。

GFP作為示蹤標(biāo)記，對(duì)宿主細(xì)胞不具有毒性，不會(huì)影響目的蛋白的表達(dá)，可以直接在顯微鏡下觀察融合蛋白表達(dá)和定位，因此在融合蛋白真核表達(dá)研究中具有不可替代的作用［21-23］。由于HEK293 細(xì)胞生長繁殖速度快且極少表達(dá)細(xì)胞外配體所需的內(nèi)生受體，且比較容易轉(zhuǎn)染［24-25］，因此選用HEK293T 細(xì)胞作為目的細(xì)胞。本研究構(gòu)建SIRPα-GFP 真核表達(dá)載體，利用GFP 起到示蹤的目的，熒光顯微鏡下觀察HEK293T 細(xì)胞中融合蛋白的表達(dá)及定位，結(jié)果表明：SIRPα-GFP 融合蛋白在HEK293T 細(xì)胞膜上表達(dá)；Western blotting 法檢測結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了重組質(zhì)粒SIRPα-GFP 轉(zhuǎn)染HEK293T 細(xì)胞后融合蛋白的表達(dá)。

綜上所述，本研究成功構(gòu)建了SIRPα-GFP 真核表達(dá)載體，并利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑成功轉(zhuǎn)染HEK293T 細(xì)胞，SIRPα-GFP 融合蛋白在HEK293T細(xì)胞中表達(dá)并位于HEK293T 細(xì)胞膜上，為后續(xù)SIRPα 的功能研究奠定基礎(chǔ)。