殷白丁，胡玉霞，靳 紅，吐達洪，汪 晶*

0 引言

糖尿病的微血管并發(fā)癥在糖尿病中占有相當大的比例[1]。其中，糖尿病腎病(Diabetic nephropathy，DN)是糖尿病對腎臟組織最嚴重的一種損傷，是終末期腎臟疾病和腎衰竭的主要原因[2-3]。研究表明，大約有15%～40%的1型或2型糖尿病患者患有DN[4]。除了慢性持續(xù)性高血糖，包括慢性炎癥、血脂障礙和高級糖基終產(chǎn)物(Advanced glycation end products,AGEs)積累在內(nèi)的其他因素也能很大程度上影響DN的發(fā)病和進程[5]。

AGEs與DN的發(fā)病機制密切相關(guān)，氨基胍和吡多胺等AGEs抑制劑能減輕糖尿病患者的腎損害[6]。研究表明，AGEs不但能與其受體發(fā)生相互作用，隨之改變細胞內(nèi)發(fā)出促進炎性細胞因子釋放的信號，還能與其他通路相互溝通[7]。糖尿病中過多的AGEs會觸發(fā)細胞凋亡通路，AGEs誘導(dǎo)的凋亡能引起基底膜增厚，最終導(dǎo)致腎小球功能喪失[8]。DN的動物模型闡釋了抑制AGEs形成或抑制AGEs誘導(dǎo)凋亡的藥物都具有一定的腎臟保護作用。

細胞核因子2相關(guān)的因子2/抗氧化反應(yīng)元素(Nrf2/ARE)發(fā)出的信號在控制編碼內(nèi)生抗氧化酶基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[9]。第Ⅱ階段抗氧化酶包括血紅素加氧酶-1(HO-1)、煙酰胺腺苷二核苷酸磷酸[NAD(P)H]奎寧氧化酶-1(NQO-1)和γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)。有報道，由于有抑制氧化應(yīng)激、提高腎臟保護功能的作用，Nrf2介導(dǎo)的抗氧化酶成為了一種有前途的治療靶點[10]。

Sal是一種從中藥紅景天中分離出來的植物皂苷，可以治療心血管疾病和腦血管疾病[11]。文獻報道，Sal通過抑制BIM介導(dǎo)的大鼠近端腎小管細胞凋亡對DN起保護作用[12]。此外，Sal通過上調(diào)opg/rankl比率改善卵巢切除糖尿病大鼠的骨組織形態(tài)并防止骨丟失[13]。然而，Sal對于DN的作用尚未明確，相關(guān)分子機制也仍不清楚。

1 材料和方法

1.1 試劑和材料 紅景天苷購自上海阿拉丁生物科技發(fā)展有限公司(上海，中國)。二甲雙胍(中美施貴寶制藥有限公司，上海，中國)作為陽性對照。細胞培養(yǎng)材料:杜爾貝科修改鷹介質(zhì)(DMEM)、胎牛血清(FBS)、青霉素/鏈霉素均購自Gibco(上海，中國)。3-[4,5-二甲基噻唑-2-基]-2,5-二苯基四唑溴化銨(MTT)、鋅原卟啉(ZNPP)和其他化學(xué)用品均購自西格瑪·奧爾德里奇(美國)。AGE測定試劑盒購自上海韋斯坦生物科技有限公司。Caspase-3以及caspase-9細胞活性試劑盒(碧云天，中國)，Nrf2(sc-13032)、Bcl-2(sc-7382)和Bax(sc-4239)購自圣克魯斯生物技術(shù)公司。其他相關(guān)試劑以及β-actin均購自碧云天生物科技有限公司(上海，中國)。

AGE/牛血清白蛋白(BSA)的制備：根據(jù)Zhang等[3]的方案制備了AGE-BSA。用0.792 6 g D-葡萄糖在37 ℃下培養(yǎng)8周，將0.07 g牛血清白蛋白加入PBS中。對照白蛋白在沒有葡萄糖的情況下培養(yǎng)。使用皮爾斯內(nèi)毒素去除凝膠去除內(nèi)毒素，并使用毒素傳感器TM顯色LAL，內(nèi)毒素檢測試劑盒(金斯瑞生物科技，美國)檢測內(nèi)毒素，規(guī)格小于500 U/L。

1.2 動物和分組 雌性db/db鼠(db/db mice)和C57BL/6J鼠(db/m，6～8周齡)均購自維通利華動物研究中心(北京，中國)。實驗所有動物均在標準條件(室溫22 ℃，濕度60%，光/暗循環(huán))下培養(yǎng)，并攝入標準顆粒物以及足夠飲用水。所有動物實驗均已被中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物委員會和北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院批準，并按照美國衛(wèi)生部出版的《國家實驗動物保健和使用指南》(NIH第85-23號出版物，1996年修訂)進行操作。在戊巴比妥麻醉下進行所有動物實驗和處死，并且盡可能讓動物少遭受痛苦。

1.3 實驗方案 所有實驗動物進入相應(yīng)培養(yǎng)環(huán)境適應(yīng)2周后，采用血糖儀(Roche)測量尾血糖水平。將空腹血糖>200 mg/dl的db/db型鼠視為糖尿病，并用于進一步的實驗。將鼠隨機分為4組(n=8)：C57BL/6組(對照組)；db/db組(模型組)；db/db+二甲雙胍200 mg/(kg·d)組(MET組)；db/db+二甲雙胍200 mg/(kg·d)+紅景天苷30 mg/(kg·d)組。用灌胃的方法給藥20周。將灌胃處理20周后的對照組和模型組鼠放在代謝籠中,測量其糖尿病相關(guān)指標。

1.4 血生化指標檢測

1.4.1 空腹血糖、血清TCH和TG水平檢測 每4周測量1次過夜禁食鼠的空腹血糖(FBG)水平。20周后，用頸椎離斷法處死實驗動物。處死前從眼眶后靜脈叢采樣，用生化試劑盒(北京中生北控生物科技股份有限公司)測定血清總膽固醇(TCH)和三酰甘油(TG)水平。

1.4.2 血清β2-微球蛋白、血尿素氮(BUN)、肌酐(CR)、AGE和尿白蛋白水平檢測 離心法(1 000×g，10 min，4 ℃)分離各組血樣中的血清樣品。按照說明書使用多模式酶標儀(Synergy Hi、Biotek、Winooski、VT、USA)和商用試劑盒(中國南京建成生物工程研究所)測定β2-MG、BUN、CR和AGE水平。根據(jù)說明(KA0489，Abnova，臺北，臺灣)使用白蛋白(鼠)ELISA試劑盒測量尿白蛋白。尿白蛋白排泄量以24 h排泄總量表示。

1.5 組織病理學(xué)檢查 將腎臟樣本固定在4%的緩沖多聚甲醛中，脫水后嵌入石蠟中。每個嵌入樣本切下厚約4 μm的切片，并用蘇木精和伊紅(HE)染色，使用光學(xué)顯微鏡進行檢查。

1.6 細胞培養(yǎng) 人腎近端小管(HK-2)細胞購自中國科學(xué)院(上海)細胞庫，在添加10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素的DMEM(葡萄糖含量5.5 mmol；Gibco，上海，中國)的培養(yǎng)基中，37 ℃、5%CO2的孵箱中培養(yǎng)。所有細胞根據(jù)實驗設(shè)計以適當?shù)拿芏蠕仢M培養(yǎng)皿中，并在實驗前培養(yǎng)24 h以達到60%～70%的濃度。

1.7 細胞活性測定 MTT法測定HK-2細胞的細胞活性。在96孔板(1×104個細胞/孔)中培養(yǎng)，細胞經(jīng)不同處理后，在37 ℃的溫度條件下，用MTT溶液(1 mg/ml最終濃度)培養(yǎng)4 h。二甲基亞砜(DMSO，150 μl/孔)溶解，用酶標儀在570 nm波長處檢測不同孔的吸光度。用MTT降低的百分比表示細胞活性。按照caspase-3以及caspase-9活性試劑盒操作流程檢測HK-2細胞的細胞活性。用酶標儀檢測相應(yīng)的吸光度。

1.8 Western blot實驗 用含1%苯甲磺酰氟醚的蛋白質(zhì)提取試劑盒(CoWin Bioscience Co.，Ltd.，Beijing，China)分離細胞質(zhì)和細胞核蛋白。通過電泳的方法在10% SDS-PAGE凝膠上分離等量(60～80 μg)的蛋白質(zhì)，并將其轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜(Millipore Corporation公司，美國)上。在含有5%(w/v)脫脂奶粉(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA，TBST)中室溫封閉2 h。然后用適當?shù)囊豢乖? ℃條件下孵育過夜。之后，用TBST進行3次洗滌，并室溫下二抗孵育2 h。用增強化學(xué)發(fā)光法進行結(jié)果觀察。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析 采用單因素方差分析和紐曼-科伊爾斯檢驗法檢測實驗數(shù)據(jù)。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Sal對db/db型鼠血清中FBG、TCH和TG水平的影響 Sal以及MET治療20周后，與模型組相比，Sal以及MET能夠明顯降低db/db鼠血清中FBG的含量(圖1A)。與模型組相比，Sal或MET能夠明顯逆轉(zhuǎn)db/db鼠血清中TCH和TG水平的降低(圖1B)。

2.2 Sal對db/db型鼠腎功能的影響 與對照組相比，db/db組24 h尿量和尿蛋白水平明顯升高(P<0.01)。MET和Sal處理20周后24 h尿量和尿蛋白水平明顯降低(P<0.01)。與對照組相比，模型組β2-MG、CR和BUN表達水平明顯升高，分別增加了115.31%、143.48%和93.11%(P<0.01)。MET和Sal能夠明顯抑制β2-MG、CR和BUN水平的升高。且Sal組β2-MG、CR和BUN水平分別降低了22.93%、54.07%和15.33%(P<0.05)。Sal和MET能明顯抑制模型組血漿中AGEs的表達。見圖2。

2.3 紅景天苷對組織病理學(xué)變化的影響 HE染色結(jié)果顯示，與對照組相比，糖尿病模型組腎小球體積增大，腎小球膜細胞增殖異常增加。模型組腎臟組織出現(xiàn)明顯的炎性浸潤區(qū)(圖3A)。Sal和MET能夠減輕模型組腎臟結(jié)構(gòu)異常(圖3A)。如圖3B所示，與對照組相比，模型組中TGF-β1和膠原蛋白的表達明顯升高(P<0.05)。Sal以及MET能夠明顯降低TGF-β1和膠原蛋白表達增加(P<0.05)。

2.4 Sal逆轉(zhuǎn)AGE誘導(dǎo)的HK-2細胞死亡 AGEs(0、50、100、200、400 μg/ml)刺激HK-2細胞24 h后，HK-2細胞活性呈濃度梯度樣降低。Sal(25 μmol/L，24 h)能夠逆轉(zhuǎn)由AGE(400 μg/ml)誘導(dǎo)的HK-2細胞活力以及LDH表達降低(P<0.05)。見圖4。

2.5 Sal對AGE誘導(dǎo)HK-2細胞凋亡的影響 與對照組相比，Sal可以逆轉(zhuǎn)AGEs誘導(dǎo)的HK-2細胞活性降低。Sal逆轉(zhuǎn)AGEs誘導(dǎo)HK-2細胞中Bcl-2表達上調(diào)以及Bax表達下調(diào)；Sal逆轉(zhuǎn)AGE導(dǎo)致的HK-2細胞中caspase-3和caspase-9的活性升高(P<0.05)。Sal能夠逆轉(zhuǎn)由AGEs誘導(dǎo)的Nrf2蛋白表達降低(P<0.05)。見圖5。

圖1 紅景天苷對db/db型鼠FBG、TCH和TG水平的影響

圖2 紅景天苷對db/db鼠尿蛋白量和腎功能指標的影響

圖3 紅景天苷對組織病理學(xué)變化的影響

圖4 Sal逆轉(zhuǎn)由AGEs誘導(dǎo)的HK-2細胞死亡

圖5 Sal對AGE誘導(dǎo)HK-2細胞凋亡的影響

3 討論

DN是糖尿病患者發(fā)生的一種進行性微血管并發(fā)癥，其特點為腎臟微血管破裂，腎小球毛細血管和腎小管間質(zhì)受到損害[1]。研究表明，慢性高血糖誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激可以引發(fā)DN的退行性通路[4]。氧化應(yīng)激不僅能導(dǎo)致DN中蛋白尿發(fā)病機制的重要因素-足細胞凋亡，還可以加速腎小球系膜細胞(MC)增殖以及細胞外基質(zhì)(ECM)蛋白過量增多[10]。本研究表明，Sal對AGEs處理的db/db型糖尿病鼠和HK-2細胞的凋亡均有保護作用。db/db鼠表現(xiàn)出特征性腎臟功能紊亂，包括FBG、TG、TCH、BUN和CR水平升高以及腎小球結(jié)構(gòu)異常。而Sal及MET均可以降低db/db鼠的尿白蛋白，降低血清TG、TCH、BUN、CR以及β2-MG的水平，減輕腎的病理結(jié)構(gòu)變化程度，使TGF-β1和膠原蛋白Ⅰ的表達水平下調(diào)，對DN的保護作用很明顯。此外，Sal通過促進Nrf2在AGEs處理的糖尿病鼠和HK-2細胞中的表達，抑制細胞凋亡。

研究表明，TGF-β信號通路是DN發(fā)展中起關(guān)鍵作用的一條通路，且在糖尿病患者和動物模型的腎小球中被激活[14]。研究發(fā)現(xiàn)，AGEs可以誘導(dǎo)TGF-β信號激活[15]。本研究結(jié)果表明，AGEs處理的糖尿病鼠和HK-2細胞中TGF-β1和膠原蛋白Ⅰ表達均上調(diào)，Sal能夠逆轉(zhuǎn)由AGE誘導(dǎo)的TGF-β1和膠原蛋白Ⅰ表達上調(diào)，表明Sal可能通過抑制TGF-β1通路抑制糖尿病誘導(dǎo)的纖維化。同時，AGEs可降低HK-2細胞活性，增加細胞LDH表達，而Sal能夠逆轉(zhuǎn)由AGEs誘導(dǎo)的細胞死亡。以上結(jié)果表明，Sal可通過減輕AGEs誘導(dǎo)的損傷起到保護作用。

綜上所述，Sal通過促進Nrf2表達來調(diào)節(jié)線粒體凋亡途徑，進而參與了DN對于腎臟細胞的損傷，產(chǎn)生與MET相似的作用。同時，本研究結(jié)果表明，Sal可能對除葡萄糖控制以外的DN具有潛在的治療作用。