李艾芳，陳思宇，黃一丹，王 江

0 引言

急性腦梗死(Acute cerebral infarction，ACI)作為一種常見的臨床心腦血管疾病，具有很高的發(fā)病率和死亡率。其主要是由腦血流量暫時(shí)或永久減少造成的，與腦動(dòng)脈有關(guān)[1-2]。目前，溶栓重組組織纖溶酶原激活劑是ACI臨床治療中廣泛應(yīng)用且有效的藥物，但其存在很多不良反應(yīng)[3-4]。右美托咪定(Dex)是一種高度選擇性的α2腎上腺素能受體激動(dòng)劑，具有降低交感神經(jīng)張力和鎮(zhèn)痛作用。研究證明，Dex對(duì)腦缺血再灌注損傷發(fā)揮保護(hù)作用[5-6]。黃連素(BBR)是一種異喹啉衍生的生物堿，在我國(guó)有很長(zhǎng)的應(yīng)用史，在局灶性腦缺血和缺血再灌注損傷中發(fā)揮保護(hù)作用[7-8]。

連接蛋白(Cx)是一種膜蛋白，是細(xì)胞間隙連接的重要組成部分[9]。連接蛋白43(Cx43)是腦中表達(dá)量最高的Cx，通過間隙連接調(diào)節(jié)細(xì)胞間物質(zhì)交換和電信號(hào)傳導(dǎo)，從而調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞的生長(zhǎng)分化和生理功能[9]，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的調(diào)節(jié)中起著重要作用[10]。水通道蛋白(AQP)對(duì)調(diào)節(jié)腦水平衡和神經(jīng)系統(tǒng)疾病的臨床治療具有重要意義[11]。AQP4主要在星形膠質(zhì)細(xì)胞、室管膜細(xì)胞、軟性腦膜、脈絡(luò)膜叢和大腦下丘核中表達(dá)。在早期缺血性卒中的發(fā)病過程中，AQP4在腦水腫的形成和消散中起著至關(guān)重要的作用[12]。最近研究表明，由自由基、神經(jīng)元凋亡，興奮性氨基酸毒性以及腦組織代謝異常引起的損傷和炎癥都與ACI的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)[13-14]。

本研究采用栓線法建立MCAO大鼠模型，旨在探究黃連素聯(lián)合右美托咪定是否對(duì)MCAO大鼠模型發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，以期為ACI的有效治療提供新的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 45只雄性SD大鼠(7～8周，250～280 g)購(gòu)自新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；黃連素、鼠抗GAPDH抗體購(gòu)自Sigma公司；右美托咪定購(gòu)自上海恒瑞醫(yī)藥有限公司；BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自Beyotime公司；蛋白上樣緩沖液(5×)、RIPA裂解液、丙二醛(MDA)含量檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Solarbio公司；超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)ELISA試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；兔抗Bax、Bcl-2、Cx43和AQP4抗體購(gòu)自Abcam公司；HRP標(biāo)記二抗和FITC標(biāo)記二抗購(gòu)自北京全式金生物；ECL化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京愛必信生物技術(shù)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 分組 SD大鼠隨機(jī)分為5組，每組9只：假手術(shù)組、模型組、黃連素(BBR)組、右美托咪定(Dex)組、黃連素+右美托咪定(BBR+Dex)組。

1.2.2 ACI模型建立 通過大腦中動(dòng)脈閉塞(MCAO)[15]建立ACI大鼠模型。將模型組、BBR組、Dex組和BBR+Dex組大鼠用水合氯醛(400 mg/kg)麻醉，仰臥位固定。直腸溫度維持在(37.0±0.5) ℃。頸正中線開口，暴露右側(cè)頸總動(dòng)脈，結(jié)扎右側(cè)頸總動(dòng)脈近心端，頸外動(dòng)脈殘端剪一小口，向頸內(nèi)動(dòng)脈插入栓線，并推進(jìn)至大腦中動(dòng)脈(插入深度約17～20 mm)，直到出現(xiàn)輕微阻力時(shí)，梗死區(qū)域即為大腦中動(dòng)脈。1.5 h后，將拴線緩慢拔出。假手術(shù)組按照上述方法分離右側(cè)頸總動(dòng)脈，但不插入栓線。最后，縫合切口，將所有大鼠放回籠中。

1.2.3 動(dòng)物給藥 大鼠按照“1.2.1”項(xiàng)進(jìn)行分組，BBR組灌胃黃連素(100 mg/kg)，Dex組腹腔注射右美托咪定(1 μg/kg)，BBR+Dex組灌胃黃連素(100 mg/kg)的同時(shí)腹腔注射右美托咪定(1 μg/kg)，每天1次，手術(shù)后連續(xù)給藥7 d。模型組和假手術(shù)組大鼠灌胃和腹腔注射等量生理鹽水。

1.2.4 神經(jīng)功能缺失體征評(píng)分 參考Longa 5分制法[15]，手術(shù)后24 h進(jìn)行評(píng)分。0分：無神經(jīng)損傷癥狀；1分：不能完全伸展對(duì)側(cè)前爪；2分：向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈；3分：向?qū)?cè)傾倒；4分：不能自發(fā)行走，意識(shí)喪失。分值越高，說明動(dòng)物行為障礙越嚴(yán)重。

1.2.5 腦梗死面積評(píng)估 在神經(jīng)功能缺失體征評(píng)分后，脫頸椎處死大鼠，從頸椎處剪斷頸髓，取出腦組織。-20 ℃條件下速凍20 min后，將腦組織沿冠狀位切片。切片置于2% 2,3,5-三苯基四唑氯化物(TTC)染液中，37 ℃孵育30 min。將所有切片于4%多聚甲醛中固定24 h。隨后，Image J軟件分析腦梗死面積。

1.2.6 抗氧化酶活性和丙二醛含量測(cè)定 各組大鼠連續(xù)給藥7 d后，過量10%水合氯醛(4 ml/kg，腹腔注射)處死大鼠，取大鼠海馬組織。根據(jù)檢測(cè)試劑盒說明書分別測(cè)定海馬組織中MDA的含量，以及SOD、CAT和GSH-Px活性。

1.2.7 冰凍切片免疫熒光染色 各組大鼠連續(xù)給藥7 d后，過量10%水合氯醛(4 ml/kg，腹腔注射)處死大鼠，取大鼠海馬組織。4%多聚甲醛，4 ℃條件下，固定8 h；PBS清洗后，30%蔗糖溶液脫水至組織沉底；OTC膠包埋冰凍組織塊，切片機(jī)切片；冷丙酮4 ℃固定10 min；PBS清洗后，1.2%雙氧水作用30 min；PBS清洗后，0.3% Triton X-100作用30 min；一抗Cx43(1∶400)和AQP4(1∶400) 4 ℃條件下過夜孵育；PBS清洗后，F(xiàn)ITC標(biāo)記的熒光二抗(1∶100)室溫孵育2 h；PBS清洗后，熒光顯微鏡觀察并拍照。

1.2.8 Western blot 各組大鼠連續(xù)給藥7 d后，過量10%水合氯醛(4 ml/kg，腹腔注射)處死大鼠，取大鼠海馬組織，RIPA裂解液(含蛋白酶抑制劑)冰上裂解組織30 min，4 ℃、12 000 r/min離心30 min，取上清。BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白提取物濃度。向蛋白提取物中加入蛋白上樣緩沖液(5×)，100 ℃下反應(yīng)10 min。每組取25 μg樣品進(jìn)行SDS-PAGE分離。將目的條帶轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，10%脫脂奶粉封閉3 h。加入一抗Bax(1∶1 000)、Bcl-2 (1∶500)、GAPDH (1∶20 000)，4 ℃條件下孵育8 h。TBST清洗后，HRP標(biāo)記二抗(1∶2 000)室溫孵育1 h。TBST清洗后，ECL化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒檢測(cè)目的條帶并拍照。

2 結(jié)果

2.1 黃連素聯(lián)合右美托咪定對(duì)ACI大鼠的協(xié)同保護(hù)作用 Longa 5分制法進(jìn)行ACI大鼠神經(jīng)功能缺失體征評(píng)分，TTC染色法檢測(cè)ACI大鼠腦梗死面積，結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠神經(jīng)功能缺失體征評(píng)分和腦梗死面積均顯著升高(圖1，P<0.05)，說明ACI大鼠模型造模成功；與模型組相比，BBR組、Dex組、BBR+Dex組大鼠神經(jīng)功能缺失體征評(píng)分和腦梗死面積均顯著減少(圖1，P<0.05)；與BBR組和Dex組相比，BBR+Dex組大鼠神經(jīng)功能缺失體征評(píng)分和腦梗死面積均顯著減少(圖1，P<0.05)。

圖1 黃連素聯(lián)合右美托咪定對(duì)ACI大鼠的協(xié)同保護(hù)作用

2.2 黃連素聯(lián)合右美托咪定減少ACI大鼠海馬AQP4和Cx43的表達(dá) 采用間接免疫熒光法檢測(cè)大鼠海馬AQP4和Cx43的表達(dá)。結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠海馬AQP4和Cx43的表達(dá)顯著升高(圖2A、B，P<0.05)；與模型組相比，BBR組、Dex組和BBR+Dex組大鼠海馬AQP4和Cx43的表達(dá)顯著減低(圖2A、B，P<0.05)；與BBR組和Dex組相比，BBR+Dex組大鼠海馬AQP4和Cx43的表達(dá)顯著減低(圖3A、B，P<0.05)。

2.3 黃連素聯(lián)合右美托咪定增強(qiáng)ACI大鼠海馬抗氧化能力 檢測(cè)試劑盒分別測(cè)定大鼠海馬中MDA含量，以及CAT、GSH-Px和SOD活性，結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠海馬組織中CAT、GSH-Px和SOD活性均降低(圖3A、B、C，P<0.05)，MDA含量升高(圖3D，P<0.05)；與模型組相比，BBR組、Dex組和BBR+Dex組大鼠海馬組織中CAT、GSH-Px和SOD活性均升高(圖3A、B、C，P<0.05)，MDA含量降低(圖3D，P<0.05)；與BBR組和Dex組相比，BBR+Dex組大鼠腦組織中CAT、GSH-Px和SOD活性均升高(圖3A、B、C，P<0.05)，MDA含量降低(圖3D，P<0.05)。

2.4 黃連素聯(lián)合右美托咪定抑制ACI大鼠海馬細(xì)胞凋亡 Western blot檢測(cè)大鼠海馬Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠海馬Bcl-2蛋白表達(dá)顯著降低(圖4A，P<0.05)，Bax蛋白表達(dá)顯著升高(圖4B，P<0.05)；與模型組相比，BBR組、Dex組和BBR+Dex組大鼠海馬Bcl-2蛋白表達(dá)顯著升高(圖4A，P<0.05)，Bax蛋白表達(dá)顯著降低(圖4B，P<0.05)；與BBR組和Dex組相比，BBR+Dex組大鼠海馬Bcl-2顯著升高(圖4A，P<0.05)，Bax蛋白表達(dá)顯著降低(圖4B，P<0.05)。

圖2 免疫熒光法檢測(cè)大鼠海馬AQP4和Cx43的表達(dá)

圖3 黃連素聯(lián)合右美托咪定增強(qiáng)ACI大鼠海馬抗氧化能力

3 討論

ACI是臨床上常見的腦血管疾病，是由局部缺血和腦組織壞死引起的。其特點(diǎn)是突然發(fā)作，并發(fā)癥發(fā)生率高，致殘率高，死亡率高，預(yù)后差[16]。當(dāng)冠狀動(dòng)脈阻塞時(shí)可能會(huì)發(fā)生ACI。流經(jīng)血管的血液中斷導(dǎo)致缺氧和局部缺血，其次是梗死區(qū)域厭氧，腦組織能量耗盡，最終導(dǎo)致腦組織壞死或軟化[17]。研究表明，MCAO會(huì)導(dǎo)致大鼠行為、大腦神經(jīng)化學(xué)和組織學(xué)異常，并且可以模擬人類ACI的疾病特征[18]。本研究參考Longa方法[15]，通過MACO建立ACI大鼠模型，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠神經(jīng)功能缺失體征評(píng)分(NDS)和腦梗面積均顯著增加，說明ACI大鼠模型造模成功。

右美托咪定可改善腦缺血再灌注損傷后大鼠的神經(jīng)功能、減少腦梗死面積[19]。黃連素(BBR)預(yù)處理可劑量依賴性地減少缺血性中風(fēng)小鼠的梗死面積、神經(jīng)功能缺損[20]。本研究應(yīng)用BBR聯(lián)合Dex預(yù)處理ACI大鼠模型，Longa 5分制法進(jìn)行ACI大鼠模型神經(jīng)功能缺失體征評(píng)分，TTC染色法檢測(cè)ACI大鼠模型腦梗死面積，結(jié)果顯示，與模型組相比，BBR組、Dex組、BBR+Dex組大鼠神經(jīng)功能缺失體征評(píng)分和腦梗死面積均顯著降低；與BBR組和Dex組相比，BBR+Dex組大鼠神經(jīng)功能缺失體征評(píng)分和腦梗死面積均顯著減少。以上結(jié)果說明，BBR和Dex的聯(lián)合使用與BBR和Dex的單獨(dú)使用相比，對(duì)神經(jīng)功能恢復(fù)和減少腦梗死面積有更明顯的效果。

圖4 黃連素聯(lián)合右美托咪定抑制ACI大鼠海馬細(xì)胞凋亡

缺血后再灌注(I/R)損傷后，腦組織星形膠質(zhì)細(xì)胞中Cx43的表達(dá)增加，Cx43通過間隙連接介導(dǎo)凋亡信號(hào)從缺血中心區(qū)域轉(zhuǎn)移至相鄰的缺血半暗帶，從而導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞死亡，并進(jìn)一步增加梗死面積[21]。因此，Cx43可作為神經(jīng)保護(hù)作用衡量的標(biāo)志物。研究表明，AQP4是腦損傷標(biāo)志物之一，腦缺血后AQP4水平升高，隨后導(dǎo)致缺血性腦水腫和繼發(fā)性腦損傷[22]。已有研究證明，右美托咪定對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷具有神經(jīng)保護(hù)作用[23]，BBR在阿爾茨海默癥和慢性腦灌注不足疾病中發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[24]。本研究應(yīng)用間接免疫熒光法檢測(cè)大鼠海馬AQP4和Cx43的表達(dá)，結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠海馬AQP4和Cx43的表達(dá)顯著升高；與模型組相比，BBR組、Dex組和BBR+Dex組大鼠海馬AQP4和Cx43的表達(dá)顯著減低；與BBR組和Dex組相比，BBR+Dex組大鼠海馬AQP4和Cx43的表達(dá)顯著減低。以上結(jié)果說明，BBR和Dex的聯(lián)合使用與BBR和Dex的單獨(dú)使用相比，對(duì)ACI大鼠的保護(hù)作用更為明顯。

最近研究表明，由自由基、神經(jīng)元凋亡、興奮性氨基酸毒性以及腦組織代謝異常引起的損傷和炎癥都與ACI的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)[13-14]。研究表明，氧化應(yīng)激是ACI損害的關(guān)鍵機(jī)制， 活性氧(ROS)是缺血性組織損傷的重要組成部分之一，而抗氧化酶是神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)自身免受ROS毒性侵害的主要防御方法[25]。BBR通過抗氧化作用抑制具有顱腦損傷小鼠的繼發(fā)性損傷[26]。Dex通過抑制氧化應(yīng)激，預(yù)防腦缺血/再灌注(I/R)損傷[27]。本研究應(yīng)用檢測(cè)試劑盒分別測(cè)定大鼠海馬MDA的含量以及CAT、GSH-Px和SOD活性，結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，MCAO處理顯著減弱大鼠海馬抗氧化能力；與模型組相比，BBR、Dex和BBR+Dex處理顯著增強(qiáng)大鼠海馬抗氧化能力；與BBR 組和Dex組相比，BBR+Dex處理顯著增強(qiáng)ACI大鼠海馬抗氧化能力。BBR在腦缺血疾病中發(fā)揮重要的抗凋亡作用[28]，Dex可減少腦缺血再灌注小鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組相比，MCAO處理顯著促進(jìn)細(xì)胞凋亡；與模型組相比，BBR、Dex和BBR+Dex處理顯著抑制細(xì)胞凋亡；與BBR 組和Dex組相比，BBR+Dex處理顯著抑制細(xì)胞凋亡。以上結(jié)果說明，BBR和Dex的聯(lián)合使用與BBR和Dex的單獨(dú)使用相比，對(duì)增強(qiáng)ACI大鼠海馬抗氧化能力和抑制細(xì)胞凋亡有更顯著的效果。

綜上所述，黃連素聯(lián)合右美托咪定在ACI大鼠模型中發(fā)揮協(xié)同神經(jīng)保護(hù)作用。而有關(guān)黃連素聯(lián)合右美托咪定發(fā)揮協(xié)同神經(jīng)保護(hù)作用的具體機(jī)制與調(diào)控何種信號(hào)通路有關(guān)，尚有待進(jìn)一步研究。