李 琛，許慶鐸，邊 勇

（1. 中國計量大學質(zhì)量與安全工程學院，杭州 310018；2. 中國海關(guān)科學技術(shù)研究中心，北京 100026）

0 引 言

近年來，隨著中國對外貿(mào)易持續(xù)擴大、國際旅游更加便捷及跨境電商不斷發(fā)展，中國國門生物安全形勢日趨嚴峻。外來有害生物的數(shù)量和種類出現(xiàn)前所未有的增加，危害著中國農(nóng)業(yè)、生態(tài)環(huán)境，乃至破壞經(jīng)濟、社會的穩(wěn)定，威脅國家安全。番茄環(huán)斑病毒（Tomato Ringspot Virus，ToRSV）作為一種重要的作物病原體，能夠感染大豆、番茄、煙草、葡萄、蘋果等 150 多種農(nóng)作物，導(dǎo)致嚴重的病害[1-2]。目前，ToRSV 已成為中國禁止入境的Ⅰ類檢疫性病毒[3]。

國內(nèi)外檢驗 ToRSV 的常用方法是聚合酶鏈式反應(yīng)PCR。如趙文軍等[4]采用熒光 RT-PCR 在 2 h 內(nèi)實現(xiàn)了ToRSV 的檢測；余澍瓊等[5]在PCR 的基礎(chǔ)上采用逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)（RT-LAMP）檢測出ToRSV，相比熒光 RT-PCR 縮短了近一倍時間；易汪雪等[6]采用多重RT-PCR 檢測大豆種子中的ToRSV，得到0.58μg/mL 的低檢出限。基于 PCR 的檢測方法能夠?qū)崿F(xiàn) ToRSV 的有效準確檢測，但設(shè)計特異性引物、擴增測序等操作需要專業(yè)人員進行，不適用于現(xiàn)場的快速檢測[7]。近年來備受關(guān)注的微流控技術(shù)則能夠很好的彌補這一不足。微流控技術(shù)將病毒富集、捕獲、檢測、分析等過程集成到一塊幾平方厘米的芯片中[8-10]。1992 年，Manz 等[11]在玻璃上設(shè)計微通道，從而開創(chuàng)了微流控技術(shù)，Gomez 等[12]基于微流控技術(shù)集成制造了第一個白金叉指陣列電極的硅基微流控芯片，結(jié)合阻抗法研究細胞的代謝活性。近來，微流控技術(shù)與電化學阻抗檢測方法結(jié)合的微流控阻抗傳感器愈來愈多應(yīng)用于生物檢測，且方法創(chuàng)新多樣，如基于微叉指陣列電極[13-14]、基于介電泳技術(shù)（Dielectrophoresis，DEP）[15-16]和基于納米材料（如納米粒子[17-18]、納米孔膜[19-20]和石墨烯[21]等）。不同納米材料聯(lián)用產(chǎn)生的協(xié)同效應(yīng)使得微流控阻抗傳感器在高效捕獲病菌病毒和放大阻抗信號方面的優(yōu)勢更為顯著[22]，成為近來微流控阻抗傳感器在生物檢測領(lǐng)域的研究熱點?？傊?，微流控阻抗傳感器具有快速性、特異性、試劑消耗少、無標記檢測、操作簡便和易于微型化和自動化的儀器設(shè)備開發(fā)的特點，是實現(xiàn)生物病毒現(xiàn)場檢測的理想方法[23-25]。本文針對ToRSV 的檢測問題，設(shè)計制作了嵌有金叉指陣列微電極的微流控芯片，搭建了面向ToRSV 檢測的微流控阻抗傳感器檢測平臺，根據(jù)電化學檢測原理得到阻抗譜，利用等效電路闡釋阻抗產(chǎn)生及變化機理，并進行特異性檢測試驗。最后，建立ToRSV 濃度和阻抗之間的定量關(guān)系模型，為ToRSV 的現(xiàn)場檢測提供了理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

1 微流控阻抗檢測原理及方法

1.1 微流控阻抗檢測原理

微流控阻抗檢測技術(shù)是基于微流控芯片系統(tǒng)，將生物病毒濃度轉(zhuǎn)換為電化學阻抗信號并進行快速檢測的方法，其檢測原理是以微流控芯片系統(tǒng)為平臺，首先將生物病毒抗體分子固定在微流控芯片中的導(dǎo)電換能器（金叉指陣列微電極）表面，然后將生物病毒的抗原溶液注入到介觀尺度的微流道中，病毒抗原抗體在微流道內(nèi)發(fā)生反應(yīng)后形成特異性復(fù)合物并附著在導(dǎo)電換能器上，使得導(dǎo)電換能器的阻抗特性發(fā)生變化。因此，建立阻抗信號的變化情況和檢測物濃度之間的定量關(guān)系以達到檢測的目的[26]。

1.2 番茄環(huán)斑病毒樣本溶液制備

1）先于1.5mL 離心管中加入500μL 植物蛋白提取液A、4μL 蛋白穩(wěn)定劑和2μL 蛋白酶抑制劑（以上試劑來自植物蛋白提取試劑盒C500053，生工生物工程（上海）股份有限公司生產(chǎn)），用恒溫混勻儀（型號 MSC-100，杭州奧盛儀器有限公司）混勻備用；

2）往研缽中倒入液氮，加入帶番茄環(huán)斑病毒的植物葉片研磨充分，裝入上述備好的1.5 mL 離心管中；

3）將離心管放入4°混勻儀中，速度800 r/min，振蕩 1 h，隨后放入 4°冷凍離心機（型號 5418R，德國Eppendorf 公司）中，速度12 000 r/min，離心15 min；

4）提取離心管中的上清液到一個新的1.5 mL 離心管中，取1μL 分離的上清液，使用超微量分光光度計（型號Nanodrop 2000，美國賽默飛公司）測定番茄環(huán)斑病毒濃度為26.6 mg/mL，用磷酸鹽緩沖液PBS（0.1 mol/L，pH 值 7.4）分別稀釋至 10、1、0.1、0.01 和 0.001μg/mL，于-80°保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 微流控阻抗檢測芯片和系統(tǒng)

本文設(shè)計的微流控阻抗檢測芯片分為三層：基底層、通道層和蓋片層，如圖1 所示。

圖1 微流控芯片示意圖Fig.1 Schematic of microfluidic chip

基底層采用玻璃材質(zhì)，并在玻璃基底表面通過磁控射頻濺射法噴射Cr 層，其厚度為10 nm，用以提高金箔與玻璃的粘結(jié)效率[27]；在Cr 層表面再噴射金箔層，其厚度為100 nm，并采用濕法蝕刻技術(shù)雕刻出微叉指陣列電極的圖案。 通道層采用聚二甲基硅氧烷（Polydimethylsiloxane，PDMS）材質(zhì)，并利用SU-8 陽膜刻蝕出介觀尺度的微流道；通道層包括微通道、儲液池和廢液池，微通道與金叉指電極在同一空間內(nèi)形成微反應(yīng)室，抗體與抗原免疫結(jié)合及電極檢測阻抗信號均在該區(qū)域進行。蓋板層采用PDMS 材質(zhì)，將其覆蓋在通道層之上，保障反應(yīng)空間的密封。

金叉指陣列微電極設(shè)計圖如圖 2 所示，其設(shè)計參數(shù)為：金叉指微電極對數(shù)20 對、電極高100 nm、長0.6 mm、寬 15μm、電極間距 15μm。微通道的設(shè)計參數(shù)為：長7 mm、寬0.5 mm、深100μm；儲液池和廢液池的參數(shù)為：直徑 3 mm，深 100μm；微反應(yīng)室的體積為：1.2 mm×0.5 mm×0.1 mm=0.06 mL。在蓋片層對應(yīng)儲液池和廢液池的中心打孔，直徑為0.5 mm，連接導(dǎo)管用于試劑的輸入和排出。

圖2 金叉指陣列微電極設(shè)計圖Fig.2 Schematic of gold interdigital microelectrodes

微流控芯片阻抗檢測系統(tǒng)示意圖如圖 3 所示，主要包括驅(qū)動模塊、反應(yīng)模塊和檢測模塊。驅(qū)動模塊為微量注射泵（型號Harvard，美國Harvard Apparatus 公司），注射泵通過直徑為0.5 mm 的鋼針和軟導(dǎo)管與微流控芯片的入口相連，以便將病毒檢測樣品及相關(guān)試劑按規(guī)定速率注入微流控芯片中；反應(yīng)模塊包括微流控芯片、金叉指電極，為樣品從捕捉到免疫反應(yīng)過程中現(xiàn)象的產(chǎn)生，以及阻抗變化信號產(chǎn)生提供反應(yīng)平臺；檢測模塊包括電化學工作站（型號 CS350，武漢科斯特科技有限公司）和計算機，電化學工作站與微流控芯片的金叉指微電極連接，對金叉指電極上產(chǎn)生的阻抗變化信號進行檢測，數(shù)據(jù)通過計算機配套軟件進行分析。

圖3 微流控阻抗檢測系統(tǒng)示意圖Fig.3 Schematic diagram of the microfluidic impedance detection system

1.4 試驗方法

將注射泵注入流速設(shè)定為10μL/min，電化學工作站阻抗測試參數(shù)設(shè)定為：交流激勵電壓為100 mV，測試頻率為1～100 kHz。按照下列步驟進行試驗：

1）裸電極測量：注入PBS 緩沖液測量裸電極的阻抗值，測量完成后持續(xù)注入超純水3 min 清洗微通道及微電極；

2）抗體固定：注入 15μL 濃度為 0.5 mg/mL 的 ToRSV單克隆抗體（GenScript USA Inc 生產(chǎn)）使之充滿微通道，靜置2 h。此時，PBS 緩沖溶液的pH 值為7.4、離子濃度為0.1 mol/mL，該條件下的PBS 緩沖液具有鹽平衡和穩(wěn)定 H+的作用，抗體蛋白在吸附過程中不會受 pH 和離子濃度的影響，從而會被穩(wěn)定地非特異性吸附在金電極表面。因此，在此條件下蛋白對固體材料的吸附性較好，抗體會被非特異性地吸附在金電極表面。2 h 之后用超純水清洗除去未吸附的抗體，注入PBS 緩沖液測量阻抗值，測量完成后重復(fù)清洗操作。

3）BSA 封閉：注入15μL 1%BSA 溶液（北京索萊寶科技有限公司生產(chǎn)），靜置30 min，其作用為封閉未被抗體附著的金電極表面，以免產(chǎn)生多余的干擾信號。30 min 后清洗掉多余的BSA，注入PBS 緩沖液測量阻抗值，測量完成后重復(fù)清洗操作。

4）ToRSV 檢測：注入 15μL 的 ToRSV 樣品，靜置30 min，測量阻抗值，測量完成后重復(fù)清洗操作，直至阻抗與裸電極測量時相似。

2 結(jié)果與分析

2.1 阻抗值與相角分析

利用CS350 電化學工作站在1～100 kHz 的頻率范圍內(nèi)測得50 個點的阻抗值和相位值，得到如下阻抗與檢測頻率以及相角與檢測頻率關(guān)系曲線，如圖4 所示。

圖4 不同溶液的阻抗(Z)-頻率(f)、相角-頻率(f)曲線Fig.4 Impedance(Z)-frequency(f) and phase angle-frequency(f)curves of different solutions

圖4 為不同階段的阻抗-頻率、相角-頻率關(guān)系曲線。圖4a 中，檢測頻率范圍為1～105Hz，分別測得裸電極、抗體固定、BSA 封閉電極等不同階段、不同病毒濃度對應(yīng)的阻抗值。由于檢測頻率對阻抗的影響，阻抗-頻率呈現(xiàn)如下趨勢：在1～103Hz 的低頻范圍內(nèi)，阻抗值隨著頻率的降低逐漸趨于平穩(wěn)；在1 ～100 kHz 的高頻范圍內(nèi)，阻抗值隨著頻率的降低呈線性增加的趨勢，并且各步驟下所測的阻抗值大小并無明顯區(qū)別。此外，相比于裸電極而言，在對單一PBS 緩沖液、抗體固定后以及BSA 封閉電極后的電極阻抗進行測量時發(fā)現(xiàn)，電極阻抗進一步提高，說明抗體成功固定在電極表面，且BSA 成功封閉電極中的裸露區(qū)域；當抗體捕獲ToRSV 并發(fā)生反應(yīng)后，使得電極阻抗值進一步增加，且ToRSV 濃度越高，阻抗值增幅也越大。阻抗值增加的原因是由于電極表面的抗體免疫結(jié)合病毒抗原，導(dǎo)致電極指間離子流動和電子轉(zhuǎn)移受阻，且病毒濃度與阻礙能力成正比，病毒濃度越高，離子流動和電子轉(zhuǎn)移能力受阻程度越大，因此導(dǎo)致電極阻抗增加。

圖4b 檢測頻率的范圍為1～105Hz，在裸電極、抗體固定、BSA 封閉電極等不同階段時，不同病毒濃度的相角變化曲線。相位角為-90°時說明該體系是純電容體系，相位角為0°時說明該體系是純電阻體系[28]。如圖4 所示，在低頻范圍內(nèi)（1～103Hz）相位角最低為-10°至-40°，在高頻范圍內(nèi)（1 ～100 kHz）相位角最高能接近-90°，說明阻抗的產(chǎn)生在高頻區(qū)由容抗（電容特性）占主導(dǎo)，在低頻區(qū)由阻抗（電阻特性）占主導(dǎo)。

2.2 等效電路

2.2.1 等效電路的建立

為了更好地分析高、低頻區(qū)下的電化學阻抗譜，建立了面向ToRSV 檢測的等效電路模型。等效電路模型如圖5 所示，包括：溶液電阻（Rs）、電子轉(zhuǎn)移電阻（Ret）、雙電層電容（Cdl）和介電電容（Cdi）。當電極浸入電解液中時，電極表面與溶液表面如同電容極板，同時在電極表面產(chǎn)生兩層電荷，從而構(gòu)成雙電層電容Cdl，雙電層電容Cdl表征離子對電極、溶液界面處電容的影響；電子轉(zhuǎn)移電阻Ret表征電極表面上電子轉(zhuǎn)移到溶液時生成的電阻；雙電層電容Cdl與電子轉(zhuǎn)移電阻Ret并聯(lián)，表征金叉指電極表面與溶液之間的界面所形成的阻抗。Rs表征測試溶液電阻，與雙電層電容Cdl和電子轉(zhuǎn)移電阻Ret的并聯(lián)電路串聯(lián)；Cdi表征測試溶液的介電電容，與溶液電阻Rs、雙電層電容Cdl和電子轉(zhuǎn)移電阻Ret的電路并聯(lián)。

圖5 等效電路圖Fig.5 Diagram of equivalent circuit

2.2.2 等效電路的擬合

采用 ZView 電化學阻抗分析軟件建立等效電路模型，并利用復(fù)雜非線性最小二乘法，對50 個數(shù)據(jù)點進行等效電路擬合，擬合采用Levenberg-Marquardt 迭代擬合，得到的擬合曲線為公式（1）、（2）。在擬合值與實測值的比較中發(fā)現(xiàn)，不同濃度的擬合曲線和實測點值切合度較高，因此選取10μg/mL 濃度病毒抗原的阻抗值和相角實測數(shù)據(jù)與等效電路擬合曲線加以分析該等效電路的有效性，如圖 6 所示。擬合曲線和實測曲線比較可得，阻抗值的誤差絕對值的平均值為 0.8%，最大誤差為11.9%；相角的誤差絕對值的平均值為0.7°，最大誤差為5.5°。依次對濃度為 1、0.1、0.01 和 0.001μg/mL 的病毒抗原進行實測試驗與擬合試驗，阻抗值誤差絕對值的平均值分別為0.6%、1.1%、1.2%、0.5%，相角擬合誤差絕對值的平均值分別為 0.8°、0.8°、0.5°、0.8°、1.4°。試驗結(jié)果表明，擬合曲線的擬合效果良好，本文設(shè)計的等效電路模型與微流控阻抗傳感器具有較好的擬合一致性。

圖 6 10 μg·mL-1 ToRSV 阻抗、相角擬合圖Fig.6 Fitted curves of impedance and phase angle of 10 μg·mL-1 ToRSV

等效電路中的 2 條支路Rs+Ret+Cdl和Cdi在2 個不同的頻率范圍內(nèi)控制著電流的流動。在低頻區(qū)（1～1 kHz），施加的電壓頻率不足以使電流通過病毒外殼的脂膜，因此捕獲的病毒相當于絕緣體。等效電路中相當于電流不經(jīng)過介電電容Cdi這條支路，介電電容Cdi不做功，阻抗的產(chǎn)生由Rs+Ret+Cdl支路占主導(dǎo)，其阻抗值計算符合公式（2）。在高頻區(qū)（1 ～100 k Hz），施加的電壓頻率足以使電流通過病毒外殼的脂膜，從而電流流經(jīng)Cdi支路，此時Rs+Ret+Cdl支路不做功，阻抗的產(chǎn)生由Cdi支路占主導(dǎo)，其阻抗值計算符合公式（3）。

電子轉(zhuǎn)移電阻與雙電層電容Ret∥Cdl的并聯(lián)元件阻抗值計算符合電阻和電容并聯(lián)時的阻抗計算公式[29]

式中Z1表示低頻區(qū)內(nèi)由Rs+Cdl+Ret支路所產(chǎn)生的阻抗，?；Z2表示高頻區(qū)內(nèi)Cdi支路所產(chǎn)生的阻抗，?。

2.2.3 等效電路元件對阻抗值的影響分析

為了研究阻抗變化機理，本文對等效電路各元件對阻抗值的影響進行模擬。等效電路元件在不同檢測工況下的模擬值如表1所示，同時將BSA封閉電極后檢測PBS緩沖液的實驗作為陰性對照組。

表1 不同等效電路各元件模擬值Table 1 Analog values of each component with different equivalent circuits

由表 1 可得，與對照試驗相比，當病毒濃度增加至10μg/mL 時，溶液電阻Rs從 200.71 增加到 559.78 k?，變化量為359.07 k?，較對照值200.71 k? 相比，變化率為178.9%；電子轉(zhuǎn)移電阻Ret從67.23 增加到251 k?，變化量為183.77 k?，變化率為273.3%；雙電層電容Cdl從194.03 減少到31.22 nf，變化量為-162.81 k?，變化率為了-83.9%；溶液介電電容Cdi的變化量為-0.09 nf，變化率為-3.2%。

在高頻區(qū)，阻抗的產(chǎn)生主要由溶液介電電容Cdi占主導(dǎo)，而溶液介電電容Cdi的值基本不變，在低頻區(qū)，雖然雙電層電容Cdl隨著捕獲病毒濃度增加而減少，其平均阻抗變化值約38.9 k?，約占總阻抗值變化的7.2%，表明雙電層電容的變化對阻抗值的變化有微小的影響。溶液電阻Rs和電子轉(zhuǎn)移電阻Ret隨著捕獲病毒濃度增加而顯著增加，且占總阻抗值變化的92.8%，表明阻抗的變化由溶液電阻Rs和電子轉(zhuǎn)移電阻Ret占主導(dǎo)作用。造成溶液電阻Rs及電子轉(zhuǎn)移電阻Ret增加的因素是一致的，即：ToRSV抗體捕捉病毒，使電極表面與溶液交界處、電極指間電子轉(zhuǎn)移和離子流動受阻。

2.3 ToRSV 濃度檢測

ToRSV 檢測濃度由某一檢測頻率下的阻抗響應(yīng)關(guān)系決定，選擇合適的檢測頻率能夠得到較好的阻抗響應(yīng)，從而優(yōu)化傳感器的檢測靈敏度。在相鄰頻率梯度內(nèi)，阻抗差值越大則表明檢測頻率越佳。

圖7 為各病毒濃度的平均阻抗差值?Z變化曲線，?Z是基于3 次重復(fù)測試下病毒樣品的阻抗值減去陰性對照試驗所測的阻抗值計算均值所得。?Z的變化具有相同的趨勢：在低頻區(qū)內(nèi)（1～1 kHz），?Z先增加后減少，最大平均阻抗差值落在10.7 Hz 頻率上，且該頻率下各相鄰濃度之間?Z的變化幅度也最大；在高頻區(qū)內(nèi)（1～100 kHz），?Z幾乎重合且接近于0；綜上認為10.7 Hz 是本文設(shè)計的微流控阻抗傳感器檢測ToRSV 的最佳檢測頻率。

圖7 不同濃度病毒的阻抗差值Fig.7 Variation of impedance of different concentrations of virus

圖8 顯示了在最佳檢測頻率10.7 Hz 時各病毒濃度與阻抗值Z的對應(yīng)關(guān)系，在0.001～10μg/mL 病毒濃度范圍內(nèi)，病毒濃度C和阻抗值Z可表達為

檢測限設(shè)為空白信號+3 倍信噪比，其中噪聲定義為控制對照組的標準偏差，得到此微流控阻抗傳感器的檢測限為0.003 4μg/mL，對應(yīng)的阻抗值為307.05 k?。

圖8 最佳檢測頻率（10.7 Hz）下的濃度-阻抗關(guān)系Fig.8 Concentration-impedance at the optimal detection frequency

表2 總結(jié)了番茄環(huán)斑病毒ToRSV 的其他檢測方法，相比之下，基于微流控阻抗傳感器檢測ToRSV 具有快速、簡便和高靈敏度的優(yōu)勢。

表2 ToRSV 的檢測方法比較[30-32]Table 2 Comparison of ToRSV detection methods

2.4 特異性檢驗

本文使用南方菜豆花葉病毒（Southern Bean Mosaic Virus，SBMV）、南芥菜花葉病毒（Arabis Mosaic Virus，ArMV）和煙草環(huán)斑病毒（Tobacco Ringspot Virus，TRSV）作為非靶向病毒來驗證 ToRSV 的檢驗特異性。分別對10μg/mL SBMV 溶液、10μg/mL ArMV 溶液、10μg/mL TRSV 溶液和 10μg/mL 混合 SBMV、ArMV、TRSV、ToRSV 4 種病毒的溶液進行3 次重復(fù)檢測試驗，仍以BSA封閉電極后測PBS 緩沖液的阻抗作為陰性對照得到阻抗差值。

圖9 不同病毒的阻抗差值Fig.9 Variation of impedance of different viruses

不同病毒的阻抗差值圖如圖9 所示，混合4 種病毒溶液的阻抗差值與 ToRSV 溶液的阻抗差值接近；而同濃度SBMV 溶液、ArMV 溶液和TRSV 溶液的阻抗值接近于對照組，與 ToRSV 溶液阻抗值相差較大。試驗結(jié)果表明：本文設(shè)計的面向 ToRSV 檢測的微流控阻抗傳感器能夠從ToRSV 單一溶液及含有ToRSV 的多種混合溶液中檢測出ToRSV，同時對其他病毒檢測無效。因此，證明了該傳感器對 ToRSV 具有較好的檢測特異針對性和有效性。

3 結(jié) 論

1）本文設(shè)計了一種面向 ToRSV 檢測的微流控阻抗傳感器。將ToRSV 抗體固定于微流控芯片流道中的金叉指陣列微電極表面，通過抗體與ToRSV 的免疫結(jié)合引起阻抗變化，并構(gòu)建電化學阻抗譜；

2）針對阻抗產(chǎn)生及變化機理的研究，提出了一種新的面向ToRSV 檢測的等效電路模型，并對濃度為1、0.1、0.01和0.001μg/mL 的病毒抗原分別進行實測試驗與擬合試驗，阻抗值平均誤差分別為0.6%、1.1%、1.2%、0.5%，相角擬合平均誤差分別為 0.8°、0.8°、0.5°、0.8°、1.4°，證明了等效電路模型與所設(shè)計的微流控阻抗傳感器具有較好的擬合一致性。

3）利用阻抗差值顯著性區(qū)分最佳頻率的方法，確定了ToRSV 濃度檢測的最佳頻率為10.7 Hz，建立了ToRSV濃度C與阻抗值Z的計算模型，并對檢測特異性進行檢驗。試驗結(jié)果表明，所設(shè)計的微流控阻抗傳感器檢測限為0.003 4ug/mL，且具有較好的檢測特異性和有效性。