羅益遠(yuǎn) ，陳宏降，劉師行 ，蘇 淇，李 敏*

（1.浙江醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校中藥學(xué)院，寧波，315100；2.吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院中藥學(xué)院，吉林132101）

魚(yú)腥草為三白草科植物蕺菜Houttuynia cordata Thunb.的干燥地上部分，始載于《名醫(yī)別篇》，是一種可做食物也可做藥材使用的植物。苦、甘，寒。歸肝、胃經(jīng)。具有清熱解毒，消腫散結(jié)，利尿通淋功效，為治肺雍之要藥[1～2]。主要用于疔瘡腫毒，乳癰，瘰疬，目赤，咽痛，肺癰，腸癰，濕熱黃疸，熱淋澀痛?，F(xiàn)代藥理研究表明,魚(yú)腥草中黃酮類化合物具有抗腫瘤、抗病毒、抗氧化、抗誘變和清除自由基等功能[3～4]。黃酮的提取率及其抗氧化性的強(qiáng)弱，決定著魚(yú)腥草黃酮的開(kāi)發(fā)利用價(jià)值。

纖維素酶在現(xiàn)實(shí)生活中有著很廣泛的運(yùn)用，是一種輔助作用性能很強(qiáng)的水解纖維素復(fù)合酶，使用水酶法可以降低消耗、并且能夠減少化學(xué)試劑的用量，使得實(shí)驗(yàn)條件和環(huán)境溫和的優(yōu)點(diǎn)，這相對(duì)于傳統(tǒng)的浸出法和壓榨法而言有著不少傳統(tǒng)方法無(wú)法比擬的優(yōu)點(diǎn)。這些年來(lái)，以廣泛運(yùn)用于中草藥主要成分的提取研究中[5～8]。本試驗(yàn)以魚(yú)腥草為原料，采用纖維素酶協(xié)同超聲波提取法進(jìn)行變量對(duì)比實(shí)驗(yàn)對(duì)魚(yú)腥草中總黃酮的提取工藝進(jìn)行篩選，并對(duì)其抗氧化性進(jìn)行研究。旨在為魚(yú)腥草藥材內(nèi)在質(zhì)量的綜合評(píng)價(jià)和全面控制提供新的方法參考，為魚(yú)腥草的進(jìn)一步研究提供技術(shù)基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

CP114型電子分析天平（奧豪斯儀器有限公司）；752紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) （上海奧譜勒儀器有限公司）；THC-5B型數(shù)控超聲波提取機(jī)（濟(jì)寧天華超聲電子儀器有限公司）；TD6K低速離心機(jī) （長(zhǎng)沙東旺實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；40目標(biāo)準(zhǔn)篩 （浙江上虞市道墟五四儀器廠）；蘆丁（批號(hào)：0080-9705，購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所）；纖維素酶（≥50U/mg）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、亞硝酸鈉、氫氧化鈉、硝酸鋁、無(wú)水乙醇等（以上試劑均為分析純）。

試驗(yàn)魚(yú)腥草藥材樣品為2019年實(shí)地采集，藥材采集后凈制，趁鮮剝?nèi)ネ馄ず蟾稍铮吹?。所有樣品均鑒定為三白草科植物蕺菜Houttuynia cordata Thunb.的干燥地上部分。留樣保存于吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院藥物分析實(shí)驗(yàn)室。

2 方法與結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精確稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品2mg，配制為100mL 0.02mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。用10mL的容量瓶進(jìn)行0.1mL到0.5mL的濃度梯度的稀釋，每個(gè)梯度相差0.1mL，分為5個(gè)梯度。用50%乙醇溶液補(bǔ)至2mL后用移液管移取0.3mL 5%Na2NO2溶液加入其中，振蕩過(guò)后靜置6min。再分別移取0.3mL 10%Al(NO3)3溶液加入容量瓶中，搖勻過(guò)后靜置6min。再分別加入用移液管移取的質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%NaOH溶液2mL，振蕩后用50%乙醇溶液定容至10mL，振蕩后靜置15min。以蒸餾水做空白對(duì)照，在500nm下測(cè)定吸光度，以吸光度y為縱坐標(biāo)，樣品濃度x為橫坐標(biāo)，得到回歸方程：y=7.55x+0.0757，r2=0.9992。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 提取工藝流程

提取魚(yú)腥草中總黃酮的工藝流程：魚(yú)腥草粉末→加入纖維素酶溶液→破壁水解→煮沸，使酶滅活→乙醇浸提，超聲波處理→離心→收集上清液→定容→得到總黃酮供試品溶液[13,14]。

2.3 魚(yú)腥草中總黃酮含量測(cè)定

用移液管精密量取2.0mL供試品溶液至10mL的具塞試管中，用50%乙醇溶液補(bǔ)至4mL，加入用移液管移取的 5%Na2NO2溶液0.3mL，振蕩后靜置6min，在移取10%Al(NO3)3溶液0.3mL加入，振蕩后放置6min，加入用移液管移取的2mL 4%NaOH溶液并振蕩，用50%乙醇溶液定容，搖勻后靜置15min。在500nm下測(cè)定吸光度，計(jì)算黃酮提取含量。

總黃酮提取率（%）=[(C·V1·V2)/(V3·M)]·100%

式中，C為總黃酮濃度，mg/mL；V1為溶液稀釋體積mL；V2為樣品溶液的體積，mL；M表示稱取的藥品質(zhì)量，mg；V3表示取樣體積，mL。

2.4 單因素試驗(yàn)

2.4.1 料液比對(duì)總黃酮提取率的影響

準(zhǔn)確稱取5份過(guò)40目篩的魚(yú)腥草粉末1g于100mL錐形瓶中,分別加入10mL水，調(diào)整pH為5.0。分別加入濃度為0.2mg/mL的纖維素酶溶液2mL，密封瓶口，在40℃的恒溫水浴鍋中水浴15min后將酶液置于90℃的恒溫水浴鍋中水浴5min。分別加入體積分?jǐn)?shù)為 50%的乙醇溶液 10、20、30、40 和 50ml， 然后在進(jìn)行超聲波提取，設(shè)定功率為500w，時(shí)間為50 min，離心后取上清液定容為100mL。測(cè)其吸光度，試驗(yàn)重復(fù)3次。結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 料液比對(duì)黃酮提取的影響

對(duì)以上數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)表1，得處理組間P＜F0.05，即不同的料液比對(duì)魚(yú)腥草中總黃酮的提取率在F0.05時(shí)不存在差異顯著性。為了考察最佳提取工藝的因素，此料液比將不作為正交試驗(yàn)的考察因素。

表1 料液比對(duì)提取率影響的方差分析表

2.4.2 乙醇濃度對(duì)總黃酮提取率的影響測(cè)定

準(zhǔn)確稱取5份過(guò)40目篩的魚(yú)腥草粉末1g于100mL錐形瓶中，分別加入10mL水，調(diào)整pH為5.0。分別加入濃度為0.2mg/mL的纖維素酶溶液2mL，密封瓶口，在40℃的恒溫水浴鍋中水浴15min后將酶液置于90℃的恒溫水浴鍋中水浴5min。在按1∶30的比例將一定濃度的乙醇溶液加入其中 （濃度分別為30%、40%、50%、60%和70%），密閉瓶口。在超聲波下進(jìn)行50min的提取，超聲功率設(shè)置為500w，離心后吸取上清液定容到100 mL。測(cè)定吸光度，重復(fù)3次試驗(yàn)。結(jié)果見(jiàn)圖3。根據(jù)計(jì)算出的黃酮百分含量，得出方差分析表見(jiàn)表2。結(jié)果顯示處理組間P＜0.05，即乙醇不同的體積分?jǐn)?shù)對(duì)魚(yú)腥草中總黃酮的提取率在F0.05時(shí)存在差異顯著性。為了進(jìn)一步乙醇濃度的用量對(duì)黃酮提取效果的影響及水平間的差異影響，對(duì)該因素進(jìn)行多重比較，詳見(jiàn)表3。

經(jīng)過(guò)方差分析和多重比較可知，不同的乙醇濃度30%與40%、50%之間存在極顯著差異，60%、70%與50%之間存在極顯著差異，60%與50%之間有顯著差異，50%與40%之間差異顯著，70%、60%、40%之間差異不顯著。在50%濃度下黃酮含量達(dá)到最高，為1.7523%。所以選取50%及左右兩水平（40%和60%）乙醇濃度作為正交試驗(yàn)的水平。

圖3 乙醇濃度對(duì)黃酮提取的影響

表2 乙醇濃度對(duì)黃酮提取率影響的方差分析表

表3 乙醇濃度對(duì)黃酮提取率影響的多重比較

2.4.3 提取時(shí)間對(duì)總黃酮提取率的影響

精密稱取1g魚(yú)腥草粉末于100mL錐形瓶中，然后在每一個(gè)錐形瓶里面加上10mL的水，在把每一個(gè)的pH調(diào)節(jié)到5.0之后，分別加入濃度為0.2mg/mL的纖維素酶溶液2mL，密封瓶口，在40℃的恒溫水浴鍋中水浴15min后將酶液置于90℃的恒溫水浴鍋中水浴5min。在1∶30的料液比例將50%的乙醇溶液加入其中，密封瓶口。然后在超聲波（500w）下進(jìn)行一定時(shí)長(zhǎng)的提?。ㄌ崛r(shí)間分別為 20、30、40、50 和 60min），離心，取上清液定容到100mL。測(cè)定其吸光度，重復(fù)3次。結(jié)果見(jiàn)圖4。根據(jù)計(jì)算出的黃酮百分含量，得出方差分析表見(jiàn)表4。結(jié)果顯示得處理組間P＜0.05，超聲波處理時(shí)間的長(zhǎng)短不同對(duì)魚(yú)腥草中總黃酮的提取率在F0.05時(shí)存在差異顯著性。為了進(jìn)一步考察超聲波處理時(shí)間對(duì)黃酮提取效果的影響及水平間的差異影響，對(duì)該因素進(jìn)行多重比較，詳見(jiàn)表5。

經(jīng)過(guò)對(duì)方差分析和多重比較可知，當(dāng)超聲波處理時(shí)間為30min時(shí)與其他各組超聲波的處理時(shí)間的總黃酮提取率有著顯著差異，60min與40min和30min處理時(shí)間之間有著顯著差異，60min與20min和50min處理時(shí)間之間的差異不顯著，超聲波處理時(shí)間為30min時(shí)黃酮的提取率達(dá)到最大，約為1.8629%，所以選取20、30、40min作為正交試驗(yàn)的水平。

圖4 提取時(shí)間對(duì)黃酮的影響

表4 提取時(shí)間對(duì)黃酮提取率影響的方差分析表

表5 乙醇濃度對(duì)黃酮提取率影響的多重比較

2.4.4 超聲功率對(duì)總黃酮提取率的影響

準(zhǔn)確稱取5份過(guò)40目篩的魚(yú)腥草粉末1g于100mL錐形瓶中，分別加入10mL水，調(diào)整pH為5.0。分別加入濃度為0.2mg/mL的纖維素酶溶液2mL，密封瓶口，在40℃的恒溫水浴鍋中水浴15min后將酶液置于90℃的恒溫水浴鍋中水浴5min。在按1∶30的料液比加入50%的乙醇溶液，密封瓶口。將超聲波功率設(shè)定為 400、500、600、700和 800w提取時(shí)間設(shè)置為50min后進(jìn)行提取，離心，取上清液定容到100mL。測(cè)定其吸光度，重復(fù)三次試驗(yàn)。結(jié)果見(jiàn)圖5。根據(jù)計(jì)算出的黃酮百分含量，得出方差分析表見(jiàn)表5。結(jié)果顯示得處理組間P＜0.05，即在該水平下超聲波處理功率對(duì)魚(yú)腥草中黃酮的提取率有顯著性差異。為了進(jìn)一步考察超聲波處理功率對(duì)黃酮提取效果的影響及水平間的差異影響，對(duì)該因素進(jìn)行多重比較，詳見(jiàn)表6。

經(jīng)過(guò)對(duì)方差分析和多重比較可知，超聲波處理功率600w、700w與其他各組超聲處理功率有極顯著差異，超聲處理功率700w與600w之間，400w、800w、500w之間差異不顯著。在超聲波功率為600w時(shí)，黃酮百分含量達(dá)到最大為1.7680%，所以選取500w、600w、700w作為正交試驗(yàn)的水平。

圖5 超聲功率對(duì)黃酮的影響

表5 提取時(shí)間對(duì)黃酮提取率影響的方差分析表

表6 乙醇濃度對(duì)黃酮提取率影響的多重比較

通過(guò)對(duì)以上4個(gè)單因素的分析，得出結(jié)果為：超聲波處理時(shí)間、乙醇濃度、超聲波功率對(duì)魚(yú)腥草中總黃酮提取率有顯著影響，即在F0.05時(shí)有差異顯著且；料液比對(duì)魚(yú)腥草中總黃酮提取率影響差異不顯著。所以選擇超聲波處理時(shí)間、乙醇濃度、超聲處理功率三個(gè)因素進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.5 正交試驗(yàn)

為了能夠更方便的考察提取總黃酮的工藝參數(shù)，對(duì)單因素試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，在本次實(shí)驗(yàn)中以纖維素酶的使用量、超聲波的處理時(shí)間、超聲波處理功率、乙醇溶液濃度分別做為單因素實(shí)驗(yàn)的變量并進(jìn)行相互對(duì)照實(shí)驗(yàn)分析，從而測(cè)得提取液中的總黃酮的含量值，用L9（34）正交表設(shè)計(jì)試驗(yàn)[9]。 根據(jù)單因素分析，選出超聲波處理時(shí)間為20、30、40min，提取劑的體積分?jǐn)?shù)為 40%、50%、60%，超聲波處理功率 500、600、700w。以此作為正交試驗(yàn)的考察因素及水平。表7設(shè)計(jì)的L9（34）正交表進(jìn)行正交試驗(yàn)。以總黃酮含量為指標(biāo)，進(jìn)一步考察，詳見(jiàn)表8。結(jié)果數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，比較各因素的提取率，我們可以得到最佳的提取工藝為：超聲時(shí)間30min，乙醇濃度60%，超聲波處理功率600w，即總黃酮提取工藝的最佳組合為A2B3C2。比較各因素提取率均值極差之間的大小，極差越大，該因素對(duì)提取率的影響越大，乙醇濃度＞超聲時(shí)間＞超聲功率，即魚(yú)腥草黃酮的提取含量的影響大小依次為：B＞A＞C。

表7 正交試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)

表8 正交試驗(yàn)結(jié)果

2.6 優(yōu)化工藝的重現(xiàn)性試驗(yàn)

根據(jù)正交試驗(yàn)確定的最佳提取工藝進(jìn)行3次優(yōu)化工藝的重現(xiàn)性試驗(yàn)，并通過(guò)試驗(yàn)結(jié)果來(lái)表明該提取工藝的穩(wěn)定性與可行性。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表9。結(jié)果顯示黃酮平均百分含量為2.8227%，RSD=0.8759%,表明此試驗(yàn)穩(wěn)定性強(qiáng)。

表9 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

2.7 魚(yú)腥草中黃酮的抗氧化研究

測(cè)試方法：配置濃度分別為 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8mg/mL 的黃酮樣品溶液各 2mL，在 25℃恒溫水浴鍋中進(jìn)行預(yù)熱后分別加入2.5mL 0.1mmol/LDPPH的無(wú)水乙醇溶液，搖勻避光充分反應(yīng)30min，在520nm下測(cè)定吸光度，以未加入樣品溶液的DPPH無(wú)水乙醇為空白參比，同時(shí)以VC做對(duì)陽(yáng)性對(duì)照。測(cè)定吸光度，重復(fù)3次試驗(yàn)，取其均值。根據(jù)3次重復(fù)試驗(yàn)的所得的吸光度值，按公式計(jì)算出黃酮樣品液及Vc對(duì)DPPH自由基的清除率，結(jié)果見(jiàn)圖6。

DPPH溶液中自由基的清除率={（A0-Ax）/A0}*100%

其中A0表示空白對(duì)照組的吸光度，Ax黃酮樣品溶液的吸光度。

結(jié)果顯示，黃酮類化合DPPH自由基的清除作用與Vc溶液相當(dāng)，說(shuō)明其具有較強(qiáng)的抗氧化能力，并且在一定范圍內(nèi)清除作用隨著黃酮類化合物濃度的提升而增加。當(dāng)濃度低于0.2mg/mL時(shí)DPPD溶液的自由基清除率隨著黃酮濃度的增加而急劇增加，當(dāng)濃度高于0.2mg/mL時(shí)，黃酮濃度對(duì)DPPH溶液自由基的清除率的的影響逐漸減小而趨于平緩。

圖6 黃酮溶液及Vc溶液對(duì)DPPH的自由基清除率

3 小結(jié)

本試驗(yàn)以魚(yú)腥草為原料，采用纖維素酶協(xié)同超聲波提取法進(jìn)行變量對(duì)比實(shí)驗(yàn)對(duì)魚(yú)腥草中總黃酮的提取工藝進(jìn)行篩選，并對(duì)其抗氧化性進(jìn)行研究。所得工藝合理，抗氧化活性較高，為魚(yú)腥草的進(jìn)一步研究提供技術(shù)基礎(chǔ)。