張露云，車環(huán)宇，于俊林，張立秋，夏廣清*，臧 皓*

（通化師范學(xué)院醫(yī)藥學(xué)院·吉林通化·134002）

中藥鑒定是中醫(yī)藥研究的重要基礎(chǔ)課題，其宗旨是解決中藥材“真?zhèn)蝺?yōu)劣”的關(guān)鍵問題，傳統(tǒng)的性狀鑒定、顯微鑒定、理化鑒定等中藥鑒定方法存在主觀性強、穩(wěn)定性和重復(fù)性差等方面的弱點。DNA條形碼是運用基因組中公認的一段DNA片段進行物種鑒定的分子診斷技術(shù)[1]。DNA分子標記是以生物間核苷酸差異為根本的標記技術(shù)，是在DNA水平上對遺傳物質(zhì)差異的反應(yīng)，能夠更精準的揭示種間、種類的差異，且不受環(huán)境、發(fā)育階段的影響，多態(tài)性強、數(shù)量豐富、分布廣泛均勻，近年來此技術(shù)已得到普遍關(guān)注，并成為生物鑒定與分類研究的熱門[2-3]。DNA條形碼用以中藥分子鑒定的新技術(shù)、可以敏捷、精確地鑒定物種，待測的樣品只需要經(jīng)過DNA提取、PCR擴增、電泳檢測、基因測序和數(shù)據(jù)庫比對，便可確定物種，能便利地進行種間區(qū)分[4-5]。

本實驗通過對東北地區(qū)6種當歸屬物種采用4種DNA條形碼序列（IST2、葉 matK、rbcL和trnH-psbA)進行系統(tǒng)地評估，對比不同序列間PCR擴增、測序成功率及不同片段的物種鑒別率等，目的是篩選得到適用于鑒定多種當歸屬物種的DNA條形碼，為東北產(chǎn)當歸屬植物鑒別提供了重要參考。

1 材料與儀器

1.1 材料

收集長白山區(qū)分布的當歸屬全部6個物種，每個物種采集3個樣本，樣品表及序列登錄號見表1。此外，從GenBank上下載尖葉藁本Ligusticumacum inatum，濱海前胡 Peucedanum japonicum，泰山前胡Peucedanum.wawrae 3個物種8個樣品的ITS2、rbcL、matK、psbA-trnH序列作為外類群，通過解析Gen-Bank的.gb 文件確保同一組 ITS2、rbcL、matK、psbA-trnH序列均來自于相同的Voucher number，即同1個樣品，從而確保序列對齊。DNA提取試劑盒(Tiangen Biotech Co)，2×PCR mix(Aidlab Biotechnologies Co)。

表1 樣本及序列登錄號

表2 從GenBank下載的外類群序列

1.2 儀器

球磨儀(德國Retsch公司MM400型)；高速離心機(德國sigma公司1-14型)；超微量分光光度計(美國Thermo公司NanoDropOne型)；電子天平(德國賽多利斯科學(xué)儀器有限公司SQP型)；聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)擴增儀（T100型)；電泳儀(北京六一生物科技有限公司DYY-6C型)；測序儀(美國Applied Biosystems公司ABI3730XL型)；凝膠成像儀 (美國 Bio-Rad公司GhemiDoc TM XRS+型)。

2 實驗方法

2.1 DNA提取及濃度測定

根據(jù)文獻[6-8]中報道的方法取硅膠干燥的葉片樣本 10～20 mg，球磨儀研磨 2 min(每秒 30 次)，隨后應(yīng)用植物基因組DNA提取試劑盒提取DNA，并測定OD值及A260/A280比值。另取一不含樣品的空管，依照上法操作以排除實驗室中可能得環(huán)境污染對實驗結(jié)果的影響。

2.2 PCR擴增、克隆及測序

根據(jù)文獻[9-11]中報道的方法擴增了ITS2、matK、rbcL和psbA-trnH序列，引物和擴增步驟如表3所示。 取 PCR 反應(yīng)體系 25 μL，2×PCR mix 12.5 μL，2.5 mM正向和反向引物各1μL，模板DNA 2 μL，滴加無菌雙蒸水至25 μL，將無模板DNA的PCR反應(yīng)設(shè)為陰性對照。使用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。使用測序儀對純化擴增的產(chǎn)物進行雙向測序。

表3 引物序列和擴增條件

2.3 數(shù)據(jù)分析

使用CondonCode Aligner V 9.0.1(CodonCode Co.,USA)軟件進行序列的比對、拼接并去除引物區(qū)域。使用隱馬爾可夫模型 (Hidden Markov Model,HMM)除去ITS2序列的5.8S rRNA和28S rRNA基因區(qū)，基于同源序列比對去除psbA-trnH序列的psbA基因序列和trnH序列，rbcL和matK去除引物后直接進行分析。MEGAX軟件用于多序列比對和構(gòu)建NJ(Neighbor-Joining)系統(tǒng)發(fā)育樹，應(yīng)用Bootstrap檢驗各分支的支持率(重復(fù)1000次)。利用PAUP 4.0軟件進行遺傳距離計算，采用自己編寫的Python程序進行DNA條形碼GAP分析。基于BLAST和Tree-Building方法進行物種鑒定。

3 實驗結(jié)果

3.1 DNA提取、PCR擴增及測序結(jié)果

DNA提取結(jié)果表明，長白山當歸屬的硅膠干燥葉片非常容易獲取高質(zhì)量的DNA，取樣10～20 mg、水浴40 min所獲得DNA的平均OD值為190.0 ng/μL，A260/A280的值均處于1.8～2.0之間，詳見表4。所有樣品均可成功地進行ITS2、psbA-trnH、matK和rbcL序列的擴增。PCR擴增產(chǎn)物利用瓊脂糖凝膠電泳檢測，電泳圖中psbA-trnH、ITS2、rbcL和matK序列的條帶大小約為300、500、750和900 bp。所有PCR產(chǎn)物均成功測序，其中ITS2序列可以得到高質(zhì)量的雙向測序峰圖，psbA-trnH序列存在兩處Ploy結(jié)構(gòu)，但是其不影響測序峰圖的質(zhì)量，由于rbcL和matK序列片段較大，測序峰圖的兩端質(zhì)量較差，需要進行人工矯正。

表4 樣品DNA的質(zhì)量

3.2 種間種內(nèi)遺傳距離和DNA條形碼GAP分析

從種間變異來看，ITS2序列的種間距離最大，為0.0447，rbcL序列的種間距離最小，為0.0005，兩者相差近90倍；ITS2序列的種間最小距離最大，為0.0346，但其種內(nèi)最大距離僅為0.0015，兩者相差約23倍，ITS2的種間最小距離顯著大于種內(nèi)最大距離；對于種內(nèi)距離，只有psbA-trnH序列的種內(nèi)距離較大，這主要是因為長鞘當歸的樣品間存在6 bp的Inversion區(qū)域，樣品HSPS3104和HSPS3106的序列為“TTCTAT”，而樣品 HSPS3105 為“ATAGAA”，造成對種內(nèi)距離的高估。種內(nèi)與種間距離的分析結(jié)果詳見表5。從DNA條形碼GAP分析來看，所有物種的ITS2和matK序列均存在DNA條形碼GAP，ITS2比matK序列的DNA條形碼GAP更明顯，說明物種的界限較清晰；3個物種的psbA-trnH序列存在DNA條形碼GAP；僅有1個物種的rbcL序列存在DNA條形碼GAP。

表5 種間種內(nèi)變異分析

3.3 基于BLAST和系統(tǒng)發(fā)育樹的物種鑒定分析

基于BLAST方法，采用在數(shù)據(jù)庫中去除自身序列的策略，實驗結(jié)果見圖1。ITS2和matK序列在樣品水平和物種水平的物種鑒定效率均為100%，表明所有物種和樣品均可以被鑒定。psbA-trnH序列在樣品水平和物種水平的物種鑒定效率分別為61.11%和50%，物種水平和樣品水平的物種鑒定效率不一致的原因為長鞘當歸的樣品HSPS3105的Inversion方向，與樣品HSPS3104和HSPS3106的Inversion方向不同，導(dǎo)致HSPS3105樣品鑒定失敗。rbcL序列的物種鑒定能力僅為16.67%，是最低的。圖2-5所示的分析結(jié)果表明，在以ITS2和matK序列構(gòu)建的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹中，6個物種均可聚為獨立的分枝，這可以清晰的相互區(qū)分，ITS2序列構(gòu)建的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹的枝長差異更明顯；基于psbA-trnH序列，長鞘當歸分為兩個枝，朝鮮當歸與黑水當歸聚為一個枝，無法區(qū)分；對于rbcL序列，僅有拐芹聚為一個獨立的枝，可以與其他物種相互區(qū)分，其余5個物種相互交叉，無法區(qū)分。

圖1 基于BLAST方法的物種鑒定效率分析

圖2 基于ITS2序列構(gòu)建的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹，Bootstrap值為2000.

圖3 基于psbA-trnH序列構(gòu)建的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹，Bootstrap值為2000.

圖4 基于rbcL序列構(gòu)建的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹，Bootstrap值為2000.

圖5 基于matK序列構(gòu)建的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹，Bootstrap值為2000.

4 討論

ITS2、rbcL、matK、psbA-trnH 序列為藥用植物鑒定中的常用序列，本實驗選取這4個序列進行DNA條形碼研究，所有樣品均能成功進行序列的擴增?？傮w來看，matK序列引物的通用性較差，rbcL序列的物種鑒定效率較低，psbA-trnH序列的重復(fù)結(jié)構(gòu)較多，測序成功率較低，而ITS2序列的鑒定成功率高達100%。從系統(tǒng)發(fā)育樹可知，6種植物各自聚為一支，可以很好地區(qū)分開。以上結(jié)果表明，ITS2序列能很好地對當歸屬植物進行鑒別。

本研究首次應(yīng)用DNA條形碼技術(shù)對東北當歸屬植物進行系統(tǒng)鑒定，研究結(jié)果證明ITS2序列能夠快速、準確、有效鑒定上述植物，方法操作簡便，易于掌握?；贗TS2序列的DNA條形碼技術(shù)在當歸屬植物鑒定中的應(yīng)用有效地保障了種質(zhì)資源鑒別的真實性，具有較大潛力。

5 結(jié)論

本研究首次對東北當歸屬六種植物進行了四種DNA條形碼鑒定的序列篩選；發(fā)現(xiàn)IST2片段在東北當歸屬物種鑒定中能起到關(guān)鍵性作用，依據(jù)鑒定結(jié)果與該屬植物中的系統(tǒng)進化地位，可對易混淆和替代現(xiàn)象提供科學(xué)的闡述和鑒定依據(jù)。