陳雨姍 尹群 王杰 王相震 段劼 馬履一 賈忠奎

(省部共建森林培育與保護教育部重點實驗室(北京林業(yè)大學(xué))，北京，100083)

紅花玉蘭(MagnoliawufengensisL.Y.Ma et L.R.Wang)，又名五峰玉蘭，是北京林業(yè)大學(xué)馬履一教授團隊于2004年在湖北省五峰縣發(fā)現(xiàn)，并于2006年正式發(fā)表的木蘭科植物新種[1]。該樹種主要分布于五峰海拔1 400～2 000 m的天然次生林中，原生株不足2 000株，是珍稀的植物材料。又因其樹形高大，花被片變異豐富，花色內(nèi)外均由深紅到淺粉色，花被片數(shù)目9～46瓣不等，花型涵蓋了牡丹型、蓮花型、月季型等，是珍貴的園林綠化觀賞植物，具有極高的觀賞和科研價值。

病害是影響紅花玉蘭健康生長發(fā)育的重要因素，紅花玉蘭根腐病是一種高發(fā)于紅花玉蘭幼苗上的致命性病害。該病發(fā)生初期地上部分難以觀察，根部表皮層出現(xiàn)褐色病斑，顏色略深于健康皮層。隨著病害發(fā)展，病斑逐漸蔓延到須根、側(cè)根、主根，其木質(zhì)部相繼腐爛變黑。病害發(fā)生到一定程度時，地上部分才開始出現(xiàn)葉片變小、葉色加深、萎蔫、干枯甚至落葉的癥狀。該病害發(fā)生后不僅造成土壤有害微生物增多，還大大降低林地生產(chǎn)力以及種子、果實產(chǎn)量和質(zhì)量，影響紅花玉蘭花芽分化等發(fā)育過程，嚴(yán)重時苗木成片死亡。根腐病作為一種土傳病害，日趨影響林業(yè)可持續(xù)發(fā)展[2]。主要是由于土壤中微生物侵染致病，病原菌通過侵染植株根部傷口，直接進入植物體內(nèi)，阻礙植物通過根部吸收養(yǎng)分、水分，影響植株發(fā)育，嚴(yán)重時造成植株死亡。根腐病的病原菌主要是土壤中的真菌，1917年Thomas et al.[3]首次在弗吉尼亞州蘋果根腐病上發(fā)現(xiàn)其致病菌為多形炭角菌(Xylariapolymorpha)，之后疫霉菌[4](Pythiumspp.)、絲核菌[5](Rhizoctoniaspp.)、鐮刀菌[6](Fusariumspp.)等根腐病病原菌也被相繼報道，其中鐮刀菌最為廣泛報道，致使紅花玉蘭感染根腐病的主要病原菌也是鐮刀菌。在眾多植物病害中，根腐病較其他病害致病性強，對植株危害大，易造成大片植株死亡。每年因根腐病，造成各苗圃經(jīng)濟損失巨大。

目前，根腐病的主要防治方法有選育抗病品種、林業(yè)技術(shù)防治、化學(xué)防治和生物防治[7]。傳統(tǒng)育種方式選育抗病品種年限較長，面臨遺傳變異等不定性風(fēng)險。林業(yè)技術(shù)防治主要通過輪作、間作等手段提高植株抵御病害能力，能夠有效預(yù)防，但一旦發(fā)生大規(guī)模病害則無法起到有效防控。生物防治具有對環(huán)境污染影響小，對人類、牲畜活動干擾低的特點，但現(xiàn)階段生產(chǎn)實踐中仍主要依賴于化學(xué)藥劑。因化學(xué)藥劑見效快、效果顯著、使用方便簡潔，得到廣泛應(yīng)用。隨著生態(tài)文明建設(shè)的大力宣傳、人們綠色環(huán)保意識的逐步提升，化學(xué)藥劑也趨向低毒、低殘留、環(huán)境友好型發(fā)展。因此，科學(xué)、合理、高效、安全地使用環(huán)境友好型藥劑，才能更好地發(fā)揮藥劑的藥效，有效防治植物根腐病。

然而，近年未曾有關(guān)于紅花玉蘭根腐病化學(xué)藥劑防治的報道，因此，篩選抑制病原菌生長的化學(xué)藥劑，高效、正確使用化學(xué)藥劑已為當(dāng)前形勢所需。本研究選用不同化學(xué)藥劑，設(shè)置多個稀釋倍數(shù)，在實驗室條件下，對紅花玉蘭根腐病主要病原菌鐮刀菌的菌落生長進行研究并計算藥劑有效中質(zhì)量濃度(EC50)，旨在選擇對紅花玉蘭根腐病病原菌具有抑制作用的化學(xué)藥劑，為紅花玉蘭根腐病大田防治提供科學(xué)依據(jù)和實踐指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌種

根腐病病原菌由北京林業(yè)大學(xué)省部共建森林培育與保護教育部重點實驗室提供，分離自湖北省五峰縣王家坪種質(zhì)資源生長區(qū)的紅花玉蘭根腐病病株，鑒定為鐮刀菌(Fusariumsp.)。本試驗選擇分離比率較高的4個菌株作為供試菌株開展試驗，分別是1223-8(Fusariumsp.GenBank: KX020568.1)、1123-3(FusariumsolaniGenBank: KR049251.1)、1129-4(FusariumsolaniGenBank: KT192216.1)、1108-3(Fusariumspp.GenBank: JQ340209.1)。病原菌在PDA培養(yǎng)基上純化后置于培養(yǎng)箱25 ℃恒溫培養(yǎng)。

1.1.2 供試藥劑

本研究選用了市面上常見的6種根腐病防治化學(xué)藥劑[6，8-10]進行藥劑篩選試驗(表1)。

表1 供試藥劑情況

1.1.3 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA培養(yǎng)基)：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15 g，蒸餾水1 L。

含藥培養(yǎng)基：將6種藥劑在原基礎(chǔ)上梯度稀釋(表2)，攪拌融入未冷卻的PDA培養(yǎng)基中，配成均勻含藥平板。

表2 藥劑稀釋倍數(shù)與用量

1.2 試驗方法

1.2.1不同化學(xué)藥劑對紅花玉蘭根腐病病原菌菌落生長的抑制作用

每種藥劑設(shè)置5個稀釋倍數(shù)(表2)，共30個處理，每個處理3次重復(fù)，以不加藥劑的PDA平板作為空白對照。

菌絲生長速率法[11]：在超凈臺中，用直徑為6 mm的無菌打孔器在紅花玉蘭根腐病病原菌菌落邊緣打取菌餅，接種于含藥平板和空白對照平板中央，每個平板接種一個病原菌菌餅。接種后的平板置于培養(yǎng)箱內(nèi)25 ℃恒溫黑暗培養(yǎng)7 d，觀察菌落大小。在培養(yǎng)第3、5、7天時，采用十字交叉法測量菌落直徑，并計算抑菌率(由于第7天對照病原菌已長滿平板，試驗用第5天的數(shù)據(jù)計算抑菌率)，以血球計數(shù)法測定產(chǎn)孢量，即用25×16型血球計數(shù)板計算孢子數(shù)。

抑菌率=(處理菌落直徑-對照菌落直徑)/(處理菌落直徑-6 mm)×100%。

(1)

產(chǎn)孢量=80個方格孢子總數(shù)/80×400×10 000×稀釋倍數(shù)。

(2)

1.2.2 藥劑毒力測定

以藥劑質(zhì)量濃度(或體積分?jǐn)?shù))的對數(shù)值為x，抑菌率的機率值為y，運用SPSS22.0軟件進行回歸分析，作毒力回歸方程(y=a+bx)[12]，同時計算供試藥劑對病原菌的EC50，即當(dāng)y=50%時，求得的x是EC50的對數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗數(shù)據(jù)利用Microsoft Excel 2010統(tǒng)計整理，采用SPSS22.0統(tǒng)計分析軟件進行差異顯著性分析、相關(guān)性分析，并求出各藥劑對病原菌的毒力回歸曲線方程、EC50、95%置信區(qū)間及R2。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同化學(xué)藥劑對紅花玉蘭根腐病病原菌的抑制作用

6種化學(xué)藥劑的抑菌試驗結(jié)果表明，5種化學(xué)藥劑(代森錳鋅、惡霉靈、福美雙、根腐消、多菌靈)對紅花玉蘭根腐病病原菌(1123-3菌株、1129-4菌株、1223-8菌株、1108-3菌株)均有明顯抑制作用(P<0.05)；氰氨化鈣對1123-3菌落生長有抑制作用，對其他3個病原菌株(1129-4菌株、1223-8菌株、1108-3菌株)無顯著抑制作用(圖1)。

不同化學(xué)藥劑對同一病原菌株的抑制作用不同。對1123-3菌株，代森錳鋅、福美雙、多菌靈抑制效果比惡霉靈、根腐消、氰氨化鈣好，其中多菌靈抑菌效果最好；對1129-4菌株，福美雙和多菌靈抑制效果比代森錳鋅、惡霉靈、根腐消好，氰氨化鈣抑制效果不顯著；對1223-8菌株，氰氨化鈣無抑制作用，其他5種藥劑均抑制效果顯著；對1108-3菌株，福美雙、多菌靈抑制效果比代森錳鋅、惡霉靈、根腐消好，氰氨化鈣抑制效果不顯著(圖1)。

2.2 不同化學(xué)藥劑對紅花玉蘭根腐病病原菌產(chǎn)孢量的影響

被試菌株中1123-3菌株和1223-8菌株未產(chǎn)生孢子，因此，試驗僅統(tǒng)計1129-4菌株和1108-3菌株2個菌株的產(chǎn)孢量。抑菌試驗中發(fā)現(xiàn)，氰氨化鈣對病原菌株抑制效果不顯著，因此，試驗僅比較另5種化學(xué)藥劑對病原菌產(chǎn)孢量的影響。與對照相比，5種化學(xué)藥劑對2個病原菌株的產(chǎn)孢量均有顯著的抑制作用(表3)。

對1129-4菌株的抑制效果中，多菌靈對其產(chǎn)孢量抑制效果最顯著，且與其他藥劑有顯著差異，抑菌率達97.33%；惡霉靈的抑制效果僅次于多菌靈，抑制率為90.35%；代森錳鋅的抑制效果最差，抑菌率僅有61.76%，顯著低于其他藥劑；福美雙和根腐消間無顯著差異，抑菌率分別為82.05%和83.91%(表3)。

對1108-3菌株的抑制效果中，多菌靈抑菌效果顯著優(yōu)于其他藥劑，抑菌率為94.08%；代森錳鋅抑菌率僅有63.21%，顯著低于其他藥劑；多菌靈和惡霉靈以及惡霉靈和福美雙間的抑菌效果無顯著差異，惡霉靈、福美雙和根腐消抑菌率分別為89.02%、82.23%和74.70%(表3)。

表3 不同化學(xué)藥劑對紅花玉蘭根腐病病原菌產(chǎn)孢量的影響

綜上所述，多菌靈對1129-4菌株和1108-3菌株產(chǎn)孢量的抑制效果最好。

2.3 不同稀釋倍數(shù)化學(xué)藥劑對紅花玉蘭根腐病病原菌菌絲生長的影響

同種化學(xué)藥劑不同稀釋倍數(shù)對不同病原菌株抑制效果有差異。比如，稀釋600倍的代森錳鋅對各菌株菌落生長抑制率效果最好，抑制率效果由強到弱的排序為1123-3菌株、1223-8菌株、1129-4菌株、1108-3菌株，其中最大抑制率達91.46%，而最小抑制率僅為57.92%。同種化學(xué)藥劑稀釋倍數(shù)越小，抑制效果越好。代森錳鋅不同稀釋倍數(shù)對1123-3菌株菌落生長抑制率由大到小的排序為600、800、1 000、1 200、1 400倍，即稀釋倍數(shù)越小，抑制效果越好，最大抑制率達91.46%，最小抑制率僅為83.57%(表4)。

具有抑制作用的化學(xué)藥劑中，多菌靈抑制效果最好，不同稀釋倍數(shù)多菌靈對4個病原菌株的抑制作用差異不顯著，且對4個病原菌株的抑制率均在90%左右。其他化學(xué)藥劑不同稀釋倍數(shù)中，最小稀釋倍數(shù)和最大稀釋倍數(shù)對菌株菌落直徑大小影響顯著。除氰氨化鈣外，5種化學(xué)藥劑隨著藥劑稀釋倍數(shù)減小，病原菌菌落生長直徑呈減小趨勢，即抑制作用呈增大趨勢(表4)。

總體來說，對紅花玉蘭根腐病病原菌4個菌株抑制效果最好的是多菌靈，5種稀釋倍數(shù)的多菌靈對4個菌株的抑制率均約為90%，其中稀釋400倍的多菌靈對1123-3菌株、1129-4菌株和1223-8菌株抑菌率最大，分別為99.42%、90.15%和99.91%，稀釋400倍的多菌靈對4個病原菌株平均抑菌率為94.88%，稀釋600倍的多菌靈對1108-3菌株抑菌率最大，為90.79%。其次是福美雙，對4個菌株的抑制率均在60%以上；再次為根腐消，抑菌率均在55%以上。惡霉靈和代森錳鋅抑制率大部分低于50%，抑制率最小的分別為24.37%和28.77%(表4)。綜上，多菌靈、福美雙和根腐消3種化學(xué)藥劑抑制病原菌菌落生長效果較好。

表4 不同化學(xué)藥劑、不同稀釋倍數(shù)對紅花玉蘭根腐病病原菌菌落生長的影響

2.4 供試化學(xué)藥劑室內(nèi)毒力測定結(jié)果

通過抑菌試驗求得供試化學(xué)藥劑對不同病原菌的毒力回歸方程，結(jié)果表明，不同稀釋倍數(shù)的代森錳鋅、福美雙、惡霉靈、根腐消4種化學(xué)藥劑對紅花玉蘭根腐病4個病原菌株均有明顯抑制作用。5種稀釋倍數(shù)的氰氨化鈣只對1123-3菌株表現(xiàn)出抑制作用，因此，只求得氰氨化鈣對1123-3菌株的毒力方程，其他3個菌株無毒力方程。多菌靈不同稀釋倍數(shù)處理間對1123-3菌株抑菌效果差異不顯著，因此未對其求得毒力回歸方程(表5)。

表5 不同化學(xué)藥劑、不同稀釋倍數(shù)對紅花玉蘭根腐病病原菌菌絲生長的毒力回歸方程

2.4.1 6種化學(xué)藥劑對1123-3菌株的毒力

對于1123-3菌株，根腐消對菌絲生長抑制作用最強，其中稀釋400倍的根腐消抑制率達88.41%，EC50為0.384 mg·L-1；其次是福美雙，EC50為29.050 mg·L-1；代森錳鋅和惡霉靈抑制作用較前兩種藥劑差，EC50>100.000 mg·L-1(表5)。

2.4.2 6種化學(xué)藥劑對1129-4菌株的毒力

對于1129-4菌株，多菌靈對菌絲生長抑制作用最強，稀釋400倍時多菌靈抑制率達90.15%，EC50為0.002 mg·L-1；根腐消次之，EC50為0.691 mg·L-1；然后是福美雙和惡霉靈EC50分別為140.688 mg·L-1和369.086 mg·L-1；代森錳鋅抑制作用最弱，EC50為1 261.563 mg·L-1(表5)。

2.4.3 6種化學(xué)藥劑對1223-8菌株的毒力

從表5可以看出，根腐消的EC50值最小，為0.583 mg·L-1；其次為福美雙、惡霉靈，EC50值分別為37.676、87.050 mg·L-1；代森錳鋅的EC50值最大，為352.582 mg·L-1。結(jié)果表明，根腐消對1223-8的抑制效果最好，代森錳鋅的抑制效果最差。

2.4.4 6種化學(xué)藥劑對1108-3菌株的毒力

從表5可以看出，根腐消的EC50值最小，為0.394 mg·L-1；其次為惡霉靈、福美雙，EC50值分別為383.205、490.451 mg·L-1；代森錳鋅的EC50值最大，為1 107.251 mg·L-1。結(jié)果表明，根腐消對1108-3的抑制效果最好，代森錳鋅的抑制效果最差。

3 結(jié)論與討論

本研究的抑菌試驗結(jié)果表明，代森錳鋅、福美雙、多菌靈、惡霉靈、根腐消5種化學(xué)藥劑對紅花玉蘭根腐病病原菌(1123-3菌株、1129-4菌株、1223-8菌株、1108-3菌株)有明顯抑制作用，5種稀釋倍數(shù)的氰氨化鈣對1123-3菌落生長均有抑制作用，對其他3個病原菌株(1129-4菌株、1223-8菌株、1108-3菌株)無顯著抑制作用。

無論是對病原菌菌落生長還是產(chǎn)孢量的影響，多菌靈對4個病原菌株均表現(xiàn)出很高的抑制性。這與游景茂等[13]研究發(fā)現(xiàn)多菌靈可有效抑制白術(shù)(Atractylodesmacrocephala)根腐病病原菌生長的結(jié)果一致，他們發(fā)現(xiàn)多菌靈可濕性粉劑在室內(nèi)及田間防治效果都很好，在田間施加根腐消1 000倍液,10 d后田間防效為67.37%。多菌靈的主要成分是苯并咪唑-2-氨基甲酸丙酯，通過抑制病原菌細(xì)胞有絲分裂過程中紡錘體的形成而抑制菌絲生長[14]，有力的支持了多菌靈在白術(shù)的室內(nèi)及田間防治效果一致的試驗結(jié)果。但本研究結(jié)果僅代表多菌靈對紅花玉蘭根腐病病原菌的室內(nèi)抑制效果很好，具體田間試驗結(jié)果仍需進一步探究。

根腐消在4個病原菌株的抑制試驗中也表現(xiàn)較優(yōu)越，且相對EC50值較低，抑制作用較強。汪靜等[15]研究發(fā)現(xiàn)，根腐消600倍液對三七(Panaxnotoginseng)根腐病室內(nèi)抑制率可達100%，杜賓等[16]研究發(fā)現(xiàn)，在大棚中根腐消250倍液可有效抑制燈盞花(Erigeronbreviscapus)的根腐病發(fā)生。這說明同種藥劑針對不同植物的根腐病有不同的響應(yīng)，對于植物處于不同環(huán)境下影響效果也不同，直接導(dǎo)致在進行防治時所需藥劑稀釋倍數(shù)的差異。由于根腐消是一種內(nèi)吸性藥劑，進入土壤后與土壤的鐵、鋁離子結(jié)合增強殺菌能力，建議繼續(xù)進行紅花玉蘭根腐病大田防治試驗，研究是否在大田中和土壤作用后防治效果更佳。

室內(nèi)化學(xué)藥劑篩選試驗中，福美雙和惡霉靈對1123-3菌株、1223-8菌株抑制率達到90%以上，對1129-4菌株和1108-3菌株抑制率為20%～80%，說明福美雙和惡霉靈具有防治紅花玉蘭根腐病的潛質(zhì)，也可作為之后大田試驗的待選化學(xué)藥劑。福美雙屬于有機硫類廣譜保護性藥劑，作用機理是通過抑制病原菌的酶活性和干擾三羧酸代謝循環(huán)而導(dǎo)致病原菌死亡發(fā)揮抑制作用。惡霉靈作為一種內(nèi)吸性藥劑，具有獨特的作用機理，惡霉靈進入土壤后被土壤吸收并與土壤中的鐵、鋁等無機金屬鹽離子結(jié)合，有效抑制孢子的萌發(fā)和病原真菌菌絲體的正常生長或直接殺滅病菌。就這點來說，福美雙直接作用于菌體本身，這是其抑制作用更強的根源所在，而惡霉靈在室內(nèi)試驗中失去了與無機金屬離子結(jié)合從而增強抑菌效果的機會，在大田使用過程中，表現(xiàn)出的防治效果或許能夠進一步提升。但是，具體的防治功效還得依大田復(fù)雜的實際情況而言，紅花玉蘭苗木本身的苗齡、生長狀況、受害程度等同樣會影響藥劑的防治效果。因此，今后兩種藥劑的大田試驗是必不可少且更具實踐意義的。

代森錳鋅對1129-4菌株和1108-3菌株的孢子及菌落生長抑制率僅60%左右，對另2個病原菌株的抑制率較其他藥劑也并未體現(xiàn)得很高，并且對4個病原菌株的EC50值都相對較大，在實際應(yīng)用中建議紅花玉蘭種植戶慎重考慮。代森錳鋅在銀杏上也并未表現(xiàn)出絕對優(yōu)勢，俞家楠等[17]研究發(fā)現(xiàn)，代森錳鋅對銀杏根腐病病原菌抑制率僅44.17%。代森錳鋅是一種二硫代氨基甲酸鹽類廣譜保護性藥劑，主要是通過抑制病原菌株體內(nèi)丙酮酸的氧化阻礙菌株能量供應(yīng)達到抑菌效果[10]。Reglinski et al.[9]研究發(fā)現(xiàn)，對輻射松(Pinusradiata)剪枝一周后施用代森錳鋅可有效抑制根腐病。結(jié)合代森錳鋅作用機理說明雖同為根腐病，同一藥劑在不同植物中抑制效果不同，可能是因為藥劑對不同病原菌抑制其體內(nèi)代謝效果不同，具體植物仍需進行進一步研究和探討。

氰氨化鈣對4個病原菌株的抑制效果較差，僅對1123-3菌株表現(xiàn)出較高的抑制率，不建議作為紅花玉蘭根腐病的防治藥劑。氰氨化鈣是一種環(huán)保型高效土壤消毒劑[18]，主要是在土壤中分解，其分解中間產(chǎn)物單氰胺和雙氰胺具有消毒、滅蟲和防病的作用。由于氰氨化鈣主要在土壤中作用，其并未在室內(nèi)平板試驗中表現(xiàn)出優(yōu)良品質(zhì)。氰氨化鈣分解后含有氮和鈣離子，一定質(zhì)量濃度的氮素及鈣離子能有效促進菌絲生長[19]，這就解釋了為什么部分稀釋倍數(shù)的氰氨化鈣對菌絲菌落生長表現(xiàn)出抑制率為負(fù)。氰氨化鈣雖為環(huán)境友好型土壤消毒劑，人體吸入其粉可能產(chǎn)生急性毒性，具有一定的風(fēng)險，使用時需謹(jǐn)慎。試驗結(jié)果不推薦將氰氨化鈣投入到防治紅花玉蘭根腐病的實際應(yīng)用中。

代森錳鋅、福美雙、多菌靈、惡霉靈、根腐消這5種化學(xué)藥劑均具有抗菌譜較廣、高效、低毒的特點，且對4個病原菌株均有較好的抑制效果，建議生產(chǎn)上可5種藥劑交替使用，以有效控制根腐病害，防止病原菌對某種單一試劑產(chǎn)生抗藥性。在室內(nèi)運用抑菌試驗進行化學(xué)藥劑的篩選僅代表藥劑與病原菌直接接觸時藥劑對病原菌菌絲生長及產(chǎn)孢的抑制效果，而藥劑在田間對病害的防治效果不僅與藥劑對病原菌菌絲抑制有關(guān)，還與藥劑作用機理、施藥技術(shù)、施藥天氣狀況等因素有關(guān)。本研究僅代表室內(nèi)篩選效果，不代表大田研究結(jié)果，可基于本試驗結(jié)果進行大田防治研究及評價。