陳俊潔 梅松 胡彥如

摘 要：脫落酸（abscisic acid，ABA）激素是一類重要的生長調(diào)節(jié)物質(zhì)，參與調(diào)控植物的多種生理過程?；ㄇ嗨兀╝nthocyanins）是植物次生代謝產(chǎn)生的類黃酮化合物，對(duì)植物的生長發(fā)育和逆境脅迫響應(yīng)有重要作用。該文以擬南芥（Arabidopsis thaliana）為研究對(duì)象，探討ABA信號(hào)對(duì)花青素生物合成的調(diào)控功能和作用機(jī)制。結(jié)果表明：外源施加ABA顯著提高野生型幼苗莖尖中花青素的積累。相一致的是，ABA能誘導(dǎo)某些與花青素合成相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子及合成酶基因的表達(dá)。遺傳學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，ABA誘導(dǎo)花青素合成部分依賴于MBW復(fù)合體中的核心轉(zhuǎn)錄因子，如TTG1、TT8及MYB75等。初步機(jī)制研究揭示，ABA信號(hào)途徑中的bZIP類轉(zhuǎn)錄因子ABI5能與TTG1、TT8及MYB75等相互作用形成蛋白復(fù)合物。綜上結(jié)果認(rèn)為，ABA信號(hào)誘導(dǎo)擬南芥幼苗中花青素的積累，并可能通過ABI5與MBW復(fù)合體協(xié)同作用調(diào)控花青素的合成。

關(guān)鍵詞：擬南芥， 脫落酸， 花青素， ABI5轉(zhuǎn)錄因子， MBW復(fù)合體

中圖分類號(hào)：Q943

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1000-3142（2020）08-1169-12

Abstract：Abscisic acid （ABA） is a critical phytohormone and widely modulates various biological processes in plants. Anthocyanins are flavonoids produced by plant secondary metabolism and play crucial roles in plant growth and stress responses. Recently， several transcription factors and synthetase genes involved in anthocyanins biosynthesis have been well studied; however， the upstream regulatory signals mediating their synthesis remain to be further explored. In this study， we taken Arabidopsis thaliana as the research object and investigated the function and mechanism of ABA in the control of anthocyanin biosynthesis. Phenotypic analysis showed that exogenous application of ABA significantly increased the accumulation of anthocyanins in the stem ends of wild-type A. thaliana seedlings. Consistently， ABA induced the expression of certain transcription factors and synthetase genes associated with anthocyanin synthesis. In addition， genetic analysis revealed that ABA-stimulated anthocyanin synthesis is partially dependent on core transcription factors in the MBW complex that positively regulates anthocyanin synthesis， such as TTG1， TT8， and MYB75. Preliminary mechanism studies revealed that the bZIP-type transcription factor ABI5 in the ABA signaling pathway physically interacts with TTG1， TT8 and MYB75 to form a protein complex. Taken together， this study shows that ABA signaling induces anthocyanin accumulation in A. thaliana seedlings and may regulate the synthesis of anthocyanins by synergizing the ABI5 with the MBW complex.

Key words：Arabidopsis thaliana， ABA， anthocyanin， ABI5 transcription factor， MBW complex

花青素是植物次級(jí)代謝產(chǎn)生的一類水溶性天然色素，屬于類黃酮化合物，在食品營養(yǎng)和醫(yī)藥保健中具有重要的應(yīng)用價(jià)值（Peiffer et al.， 2016;Wei et al.， 2018）。它廣泛存在于被子植物中，是植物生長過程中形成的重要成分。花青素在提高植物耐逆境脅迫能力方面發(fā)揮重要作用，對(duì)植物生長繁殖及對(duì)環(huán)境適應(yīng)有重要意義（Rowan et al.， 2009;Fan et al.， 2016;Liang & He，2018）。參與花青素合成途徑的基因可分為結(jié)構(gòu)基因和調(diào)控基因兩類。結(jié)構(gòu)基因包括早期生物合成基因（如CHS、CHI和F3H）和晚期生物合成基因（如DFR、ANS和UF3GT）（Tanaka et al.， 2008;Zhang & Schrader，2017）。目前研究發(fā)現(xiàn)參與花青素合成的調(diào)控基因主要編碼MYB、bHLH和WD40家族蛋白（Deng & Lu，2017;Ma & Constabel，2019）。PAP1為R2R3 MYB家族成員MYB75，它與同源蛋白PAP2/MYB90協(xié)調(diào)正調(diào)節(jié)花青素合成相關(guān)基因的表達(dá)，如PAL、CHS 和 DFR 等（Maier et al.， 2013;Shin et al.， 2015）。此外，Gonzalez et al.（2008）證明了MYB113或MYB114的過表達(dá)也導(dǎo)致擬南芥花色素的顯著增加。TT8、GL3和EGL3蛋白屬于bHLH家族的轉(zhuǎn)錄因子，均與玉米的R轉(zhuǎn)錄因子同源，正調(diào)控?cái)M南芥花青素的生物合成（Baudry et al.， 2004;Escaray et al.， 2017）。TTG1屬于WD40蛋白家族成員的PAC1進(jìn)化枝，

Koornneef（1981）報(bào)道能控制種皮顏色、花青素積累、種子粘液和根毛發(fā)育等。MYB、bHLH和WD40調(diào)控因子通常形成三元MBW復(fù)合物發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，直接調(diào)控花青素合成基因的表達(dá)，如DFR、BAN、LDOX、TT12、TT19和AHA10（Xu et al.， 2014）。深入研究花青素生物合成途徑及調(diào)控信號(hào)有助于人們理解植物的相關(guān)生理機(jī)制，對(duì)改良植物生長狀況，提高作物經(jīng)濟(jì)效益具有潛在應(yīng)用意義。

近年來，植物激素調(diào)控花青素的生物合成得到廣泛關(guān)注。例如，通過施加外源激素可通過激活或抑制花青素合成相關(guān)基因的表達(dá)來控制水果中花青素的積累（Shen et al.， 2014;Chen et al.， 2016）。ABA激素是植物體內(nèi)重要的生長調(diào)節(jié)物質(zhì)之一，它廣泛參與調(diào)控植物的各種生理過程，如胚胎發(fā)育、種子休眠與萌發(fā)、幼苗生長、根系發(fā)育、果實(shí)成熟、葉片衰老，以及對(duì)干旱、高鹽、高滲透壓和低溫等逆境脅迫的應(yīng)答反應(yīng)（Nakashima & Yamaguchi-Shinozaki，2013;Dejonghe et al.， 2018;Brunetti et al.， 2019）。ABA信號(hào)途徑關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子ABI5屬于bZIP家族成員，可被SnRK2激酶磷酸化，主要參與調(diào)控植物的種子萌發(fā)及萌發(fā)后生長等過程（Yu et al.， 2015;Pan et al.， 2018）。ABA激素能促進(jìn)某些植物果實(shí)中花青素的合成和積累（Hiratsuka et al.， 2001;Jiang & Joyce， 2003;Shen et al.， 2014;An et al.， 2018）。但是，目前關(guān)于ABA調(diào)控?cái)M南芥花青素合成的生物學(xué)功能及分子機(jī)制仍不清楚。本研究以擬南芥為實(shí)驗(yàn)材料，通過遺傳學(xué)和分子生物學(xué)相關(guān)的實(shí)驗(yàn)方法探究了ABA對(duì)擬南芥幼苗花青素的誘導(dǎo)作用以及其信號(hào)調(diào)控?cái)M南芥幼苗花青素合成的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料及處理

所有突變體都是野生型擬南芥Columbia-0遺傳背景，突變種子tt8、myb-RNAi 和 pap1-D由楊洪全教授提供。將野生型擬南芥種子與突變體種子tt8、myb-RNAi和 pap1-D，先用20%的84消毒液漂白8 min進(jìn)行表面滅菌，再播種在含有0.6%瓊脂和1%蔗糖的1/2 MS培養(yǎng)基上（pH 5.8），在4 ℃春化24 h后置于22 ℃的長日照條件下生長（光照/黑暗為16 h/8 h）。所用ABA激素從Sigma-Aldrich公司購買，Taq DNA聚合酶購自Takara Biotechnology公司，其他常用試劑購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 ABA處理

參考An et al.（2018）的方法，將擬南芥種子播種在添加不同濃度（0、0.25、0.5、0.75 μmol·L-1）ABA的1/2 MS瓊脂培養(yǎng)基上，4 ℃春化24 h 后置于長日照條件下，并在22 ℃生長6～12 d，觀測幼苗花青素積累情況并取樣用電子顯微鏡拍照。每個(gè)樣品用ABA處理分析的生物重復(fù)不少于3個(gè)，且每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)不少于3次。

1.3 花青素含量的測定

將含有0.25 μmol·L-1 ABA的1/2 MS瓊脂培養(yǎng)基上生長的7 d齡的幼苗，包括野生型植株Col，突變體植株pap1-D、myb-RNAi和 tt8 在電子天平取樣稱重W（g）后加入1 mL鹽酸甲醇提取物（甲醇∶鹽酸體積比為99∶1），在4 ℃條件下保持在暗處振蕩24 h。13 000 r·min-1離心10 min，取浸出液分別在530、657 nm波長處測量吸光度（OD值），花色素苷的相對(duì)含量用公式（A530-0.25×A657）·g-1 FW計(jì)算（Xie et al.， 2016）。實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。

1.4 RNA提取和RT-qPCR

采用Hu & Yu（2014）的方法所述，使用Trizol試劑（Invitrogen）從擬南芥幼苗中提取總RNA后逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后進(jìn)行定量實(shí)時(shí)PCR（RT-qPCR）。第一鏈cDNA使用具有oligo（dT）18引物的M-Mu LV逆轉(zhuǎn)錄酶（Fermentas，EU），在20 μL反應(yīng)體積中由1.5 μg DNA酶處理的RNA合成。使用2×SYBR Green I master mix在Roche Light Cycler 480實(shí)時(shí)PCR儀上進(jìn)行RT-qPCR（Hu & Yu， 2014）。擬南芥ACTIN2基因用作基因表達(dá)的內(nèi)參基因。每個(gè)樣品用于RT-qPCR分析的生物學(xué)重復(fù)至少3個(gè)，且對(duì)每個(gè)生物學(xué)重復(fù)分析至少有2個(gè)技術(shù)重復(fù)。用于檢測轉(zhuǎn)錄物的基因特異性引物見表1。

1.5 酵母雙雜交實(shí)驗(yàn) （Y2H）

ABI5的CDs全長為1 326 bp，編碼442個(gè)氨基酸。為驗(yàn)證ABI5蛋白與花青素合成相關(guān)蛋白的互作關(guān)系，將ABI5的全長序列克隆到pGBKT7構(gòu)建質(zhì)粒BD-ABI5，參考Chen et al.（2012）構(gòu)建分段質(zhì)粒：BD-ABI51-164、BD-ABI5165-220、BD-ABI5165-442、BD-ABI5221-349和BD-ABI5350-442。將花青素合成相關(guān)促進(jìn)因子的編碼序列克隆到載體pGADT7中構(gòu)得質(zhì)粒AD-MYB75、AD-MYB90、AD-MYB113、AD-MYB114、AD-TT8和AD-TTG1。參考Xie et al.（2016）的方法，分別將其分段為N端和C端：MYB75的第1～122個(gè)氨基酸為N端，第123～249個(gè)氨基酸為C端，構(gòu)建分段質(zhì)粒AD-MYB75-N和AD-MYB75-C;MYB113的第1～123個(gè)氨基酸為N端，第124～247個(gè)氨基酸為C端，構(gòu)建分段質(zhì)粒AD-MYB113-N和AD-MYB113-C;TT8的第1～358個(gè)氨基酸為N端，第359～519個(gè)氨基酸為C端，構(gòu)建分段質(zhì)粒AD-TT8-N和AD-TT8-C;TTG1的第1～174個(gè)氨基酸為N端，第175～342個(gè)氨基酸為C端，構(gòu)建分段質(zhì)粒AD-TTG1-N和AD-TTG1-C。將融合于不同載體的質(zhì)粒進(jìn)行酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)。用于構(gòu)建各種克隆的引物見表2。

1.6 雙分子熒光互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)（BiFC Assays）

將173個(gè)氨基酸N末端增強(qiáng)的YFP（nYFP）和64個(gè)氨基酸C末端片段（cYFP）的cDNA序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增并克隆到pFGC5941中分別產(chǎn)生pFGC-nYFP和pFGC-cYFP（Kim et al.， 2008）。將ABI5的編碼序列融合于pFGC-cYFP中構(gòu)建質(zhì)粒ABI5-cYFP，而MYB75、MYB90、MYB113、MYB114、TT8和TTG1的編碼序列引入pFGC-nYFP以與nYFP形成N末端框內(nèi)融合。將得到的質(zhì)粒導(dǎo)入根癌土壤桿菌（菌株GV3101）中，如Hu & Yu （2014）所述進(jìn)行煙草浸潤，將不同質(zhì)粒融合注射煙草葉片，常溫放置于暗處48 h后用熒光染料染色，撕取注射葉片部分葉肉組織涂片，在共聚焦激光掃描顯微鏡（Olympus，Tokyo，Japan）下觀察YFP和DAPI熒光。本實(shí)驗(yàn)中用于構(gòu)建各種克隆的引物見表2。

2 結(jié)果與分析

2.1 ABA促進(jìn)擬南芥幼苗中花青素的積累

將Columbia生態(tài)型背景的野生型（WT）種子播種在含有不同濃度ABA（0、0.25、0.50、0.75 μmol·L-1）的1/2 MS培養(yǎng)基上，驗(yàn)證外源施加ABA是否能誘導(dǎo)花青素的合成。觀察到，ABA濃度的增加能誘導(dǎo)植物體花青素的積累，表現(xiàn)為幼苗莖尖顏色加深，呈現(xiàn)出紫紅色的表型。進(jìn)一步用顯微鏡觀察ABA處理的幼苗表型，并拍攝不同天數(shù)的幼苗圖片。隨著ABA濃度的增加，野生型幼苗的生長越緩慢，幼苗莖尖花青素的積累越明顯（圖1：A）。通過測量不同濃度ABA處理的幼苗（光下生長6 d）中的花青素含量發(fā)現(xiàn)，野生型幼苗在不含ABA的1/2 MS板上花青素含量最低，在含0.75 μmol·L-1 ABA板上的花青素含量最高，隨著ABA濃度增加花青素含量增多（圖1：B）。測量結(jié)果與觀察到的花青素積累表型趨勢一致。這表明外源ABA處理能促進(jìn)擬南芥幼苗中花青素的生物合成，從而促進(jìn)其在植物體內(nèi)的積累，且隨著ABA濃度的增加呈遞增趨勢。

2.2 ABA誘導(dǎo)花青素合成相關(guān)基因的表達(dá)

PAL、C4H、4CL、CHS、CHI、F3H、DFR、LDOX和UF3GT等是花青素合成的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)基因，MYB75、MYB90、MYB113、MYB114、TT8、GL3、EGL3、TTG1、HY5和TT2是控制結(jié)構(gòu)基因表達(dá)的重要調(diào)節(jié)基因，它們都參與花青素合成途徑的重要酶促反應(yīng)，它們的表達(dá)量上升均能導(dǎo)致擬南芥花青素的合成途徑被激活，從而使得植物體內(nèi)的花青素含量上升（Dubos et al.， 2008;Gonzalez et al.， 2008;Petroni & Tonelli，2011）。對(duì)不同濃度ABA誘導(dǎo)處理的野生型幼苗進(jìn)行總RNA提取，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后進(jìn)行RT-qPCR實(shí)驗(yàn)，檢測上述所有花青素合成結(jié)構(gòu)基因和調(diào)控基因的相對(duì)表達(dá)量。圖2結(jié)果顯示，在ABA處理的植物中，C4H、DFR、LDOX和UF3GT等花青素結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)顯著增加，且隨著ABA濃度增加呈正相關(guān)關(guān)系。此外，MYB75、MYB90、TT8、GL3、EGL3、TTG1、TT2和HY5等調(diào)節(jié)基因的表達(dá)水平也受ABA的誘導(dǎo)。這說明ABA激素能通過上調(diào)某些花青素合成相關(guān)基因的表達(dá)水平來誘導(dǎo)擬南芥幼苗中花青素的合成。

2.3 ABA誘導(dǎo)花青素的合成部分依賴于MYB75和TT8調(diào)節(jié)蛋白

本研究進(jìn)一步通過遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)分析了ABA促進(jìn)花青素的合成是否依賴于上述調(diào)節(jié)蛋白的正常功能。我們收取同一批次的Columbia生態(tài)型背景野生型種子，花青素缺失突變體種子myb-RNAi 和tt8，以及花青素合成增強(qiáng)的植物種子pap1-D，播種到具有0.25 μmol·L-1 ABA濃度的1/2 MS培養(yǎng)基上。如圖3：A所示，光下生長6 d的野生型植物幼苗莖尖呈淺紫色，而突變體植株myb-RNAi和tt8的幼苗無明顯的顏色改變，整個(gè)莖尖以及葉片都為綠色;相反，pap1-D植物莖尖的顏色明顯比野生型植物更深。為了進(jìn)一步驗(yàn)證該結(jié)果， 本研究測量了相關(guān)植物中的花青素含量。圖3：B結(jié)果表明，突變體植株myb-RNAi和tt8 在0.25和0.5 μmol·L-1 ABA濃度的1/2 MS培養(yǎng)基上的花青素含量明顯比野生型植物低，而pap1-D植株的花青素含量顯著高于野生型植物中的。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，野生型植物在0.5 μmol·L-1 ABA濃度的1/2 MS培養(yǎng)基上花青素與0 μmol·L-1 ABA濃度的1/2 MS培養(yǎng)基上花青素的比值顯著高于突變體植株myb-RNAi和tt8相對(duì)應(yīng)的比值（圖3：C）。此外，本研究還檢測了花青素合成相關(guān)結(jié)構(gòu)基因（如DFR、LDOX和UF3GT）的表達(dá)量。提取0、0.5 μmol·L-1 ABA處理的野生型植物以及相關(guān)突變體植物的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后進(jìn)行RT-qPCR實(shí)驗(yàn)，檢測它們的相對(duì)表達(dá)量。圖3：D結(jié)果顯示，在ABA處理的情況下，DFR、LDOX和UF3GT在突變體植株myb-RNAi 和 tt8 中的相對(duì)表達(dá)量明顯低于野生型植物，而在pap1-D植株中的相對(duì)表達(dá)量明顯高于野生型植物。這表明ABA促進(jìn)擬南芥幼苗花青素的合成部分依賴于MYB75和TT8等調(diào)節(jié)蛋白的正常功能。

2.4 MYB75、TT8和TTG1蛋白與ABI5轉(zhuǎn)錄因子相互作用

為探究ABA激素調(diào)控?cái)M南芥幼苗花青素合成的分子機(jī)理，本研究使用酵母雙雜交系統(tǒng)檢測了相關(guān)蛋白之間的相互作用關(guān)系。構(gòu)建質(zhì)粒BD-ABI5作為誘餌（Bait），構(gòu)建質(zhì)粒AD-MYB75、AD-MYB90、AD-MYB113、AD-MYB114、AD-TT8以及AD-TTG1作為潛在的互作獵物（Prey）。將相關(guān)的誘餌質(zhì)粒和獵物質(zhì)粒共轉(zhuǎn)入酵母細(xì)胞中，圖4結(jié)果顯示ABI5與MYB75、MYB90、MYB113、MYB114、TT8和TTG1在酵母細(xì)胞中均有強(qiáng)相互作用。進(jìn)一步采用雙分子熒光互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)在植物體內(nèi)進(jìn)行檢測分析。將ABI5與YFP蛋白的C端融合形成ABI5-cYFP，將MYB75、MYB113、TT8和TTG1分別與YFP蛋白的N端融合形成MYB75-nYFP、MYB113-nYFP、TT8-nYFP和TTG1-nYFP。當(dāng)ABI5-cYFP與MYB75-nYFP、MYB113-nYFP、TT8-nYFP或TTG1-nYFP被共轉(zhuǎn)化到煙草葉片中時(shí)，能觀察到強(qiáng)的YFP熒光信號(hào)（圖5）。與此對(duì)應(yīng)的是，在相關(guān)的對(duì)照組中未能觀察到任何熒光信號(hào)（圖5）。這表明ABI5轉(zhuǎn)錄因子能與花青素合成相關(guān)的MYB75、TT8和TTG1等調(diào)節(jié)蛋白相互作用形成復(fù)合物。

2.5 MYB75、TT8和TTG1蛋白與ABI5轉(zhuǎn)錄因子的C端結(jié)構(gòu)域相互作用

將ABI5突變成若干區(qū)段，并構(gòu)建成相應(yīng)的誘餌質(zhì)粒（圖6）。酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，ABI5轉(zhuǎn)錄因子的C端278個(gè)氨基酸（含保守的bZIP結(jié)構(gòu)域）對(duì)于它與MYB75、TT8和TTG1等調(diào)節(jié)蛋白的相互作用是必須的。如圖6所示，當(dāng)ABI5轉(zhuǎn)錄因子缺失C端278個(gè)氨基酸時(shí)，它不能與MYB75、TT8和TTG1等調(diào)節(jié)蛋白相互作用;相反，當(dāng)ABI5轉(zhuǎn)錄因子缺失N端164個(gè)氨基酸時(shí)，它仍然可以與MYB75、TT8和TTG1等調(diào)節(jié)蛋白的相互作用。這表明ABI5的C端氨基酸結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)了它與MYB75、TT8和TTG1等調(diào)節(jié)蛋白之間的相互作用。

2.6 ABI5轉(zhuǎn)錄因子與MYB7、MYB113和TTG1的N端以及TT8的C端結(jié)構(gòu)域相互作用

分別將MYB75、MYB113、TT8和TTG1等蛋白突變?yōu)镹端和C端，并構(gòu)建成相應(yīng)的獵物質(zhì)粒（圖7）。酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，MYB7、MYB113和TTG1的N端對(duì)于它們與ABI5轉(zhuǎn)錄因子的相互作用是非常重要的，當(dāng)MYB7、MYB113和TTG1的N端缺失時(shí)，它們不能與ABI5相互作用（圖7）。相反，TT8蛋白的C端對(duì)于它與ABI5轉(zhuǎn)錄因子的相互作用是必須的，當(dāng)TT8的C端缺失時(shí)，它不能與ABI5相互作用（圖7）。

3 討論與結(jié)論

在ABA核心信號(hào)通路中，ABA結(jié)合PYR/PYL/RCAR等受體蛋白從而誘導(dǎo)后者的構(gòu)象變化，穩(wěn)定ABA受體和PP2C磷酸酶之間的相互作用，導(dǎo)致PP2C失活和SNF1相關(guān)蛋白激酶（SnRK2）的去阻遏。隨后，SnRK2磷酸化并激活許多下游信號(hào)組分，如ABI5轉(zhuǎn)錄因子、離子通道和NADPH氧化酶等，以實(shí)現(xiàn)非生物脅迫耐受（Fujii & Zhu，2009;Park et al.， 2009;Bauer et al.， 2013;Yu & Xie，2017）。此外，ABA激素能促進(jìn)某些植物果實(shí)中花青素的合成和積累，從而影響果實(shí)的品質(zhì)（Koyama et al.， 2010;Jia et al.， 2011;Shen et al.， 2014;An et al.， 2018）。例如，ABA作為信號(hào)分子調(diào)控花青素合成，發(fā)揮促進(jìn)甜櫻桃果實(shí)成熟的作用（Shen et al.， 2014）。同樣，在葡萄果皮和細(xì)胞懸浮系中，外源施加ABA可以誘導(dǎo)多個(gè)花青素合成結(jié)構(gòu)基因和調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，促進(jìn)花青素的積累（Jeong et al.， 2004;Gagné et al.， 2011）。在An et al.（2018）的研究中，他們發(fā)現(xiàn)蘋果MYB轉(zhuǎn)錄因子MdMYB1激活花青素生物合成基因的表達(dá)也響應(yīng)ABA。Loreti et al.（2008）發(fā)現(xiàn)ABA可以增強(qiáng)蔗糖誘導(dǎo)擬南芥中花青素的合成和積累，表明ABA和蔗糖對(duì)花青素的合成具有協(xié)同激活作用。已有少數(shù)研究表明ABA與植物色素或果皮顏色等存在內(nèi)在聯(lián)系，但ABA調(diào)控?cái)M南芥花青素合成的生物學(xué)功能和分子機(jī)理仍有待深入研究。

本研究發(fā)現(xiàn)，ABA處理能促進(jìn)擬南芥野生型幼苗花青素的積累，花青素含量測定結(jié)果也驗(yàn)證了同樣的結(jié)論。通過分析相關(guān)基因的表達(dá)情況，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在ABA處理的野生型植物中，C4H、DFR、LDOX和UF3GT等花青素結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)顯著增加，并且隨著ABA濃度增加呈正相關(guān)關(guān)系。除此之外，MYB75、MYB90、TT8、GL3、EGL3、TTG1、TT2和HY5等調(diào)節(jié)基因的表達(dá)水平也受ABA的誘導(dǎo)。這說明ABA激素能夠通過上調(diào)花青素合成相關(guān)基因的表達(dá)水平來誘導(dǎo)擬南芥幼苗中花青素的合成。本研究進(jìn)一步對(duì)花青素合成相關(guān)的突變體植物，如myb-RNAi、tt8和pap1-D，進(jìn)行了外源ABA激素處理。通過表型分析發(fā)現(xiàn)，突變體植株myb-RNAi和tt8的花青素含量明顯比野生型植物低，而pap1-D植株的花青素含量顯著高于野生型植物中的。與此相一致的是在ABA處理的情況下，DFR、LDOX和UF3GT等結(jié)構(gòu)基因在突變體植株myb-RNAi和tt8中的相對(duì)表達(dá)量明顯較野生型植物低，而在pap1-D植株中的相對(duì)表達(dá)量明顯較野生型植物高。綜上所述，本研究認(rèn)為ABA激素誘導(dǎo)擬南芥幼苗中花青素的合成可能需要MYB75和TT8等調(diào)節(jié)蛋白。

ABI5轉(zhuǎn)錄因子是植物ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子之一，可以參與調(diào)控植物種子萌發(fā)以及幼苗生長等生理過程（Finkelstein，2006;Pan et al.， 2018），還可通過與其他蛋白相互作用介導(dǎo)不同信號(hào)途徑之間的交互作用（Yu et al.， 2015）。ABA是否通過ABI5與花青素合成調(diào)控因子（如MYB75、TT8和TTG1等）之間發(fā)生相互作用，從而影響花青素的生物合成。本研究中，ABI5轉(zhuǎn)錄因子確實(shí)能與花青素合成相關(guān)的重要調(diào)節(jié)蛋白相互作用，如MYB類的MYB75、MYB90、MYB13和MYB114，bHLH類的TT8，以及WD40類的TTG1。通過進(jìn)行分段實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了ABI5與花青素合成相關(guān)調(diào)節(jié)蛋白發(fā)生相互作用的具體氨基酸結(jié)構(gòu)域。這表明ABI5轉(zhuǎn)錄因子的C端278個(gè)氨基酸（含保守的bZIP結(jié)構(gòu)域）對(duì)于它與MYB75、TT8和TTG1等調(diào)節(jié)蛋白的相互作用是非常重要的。當(dāng)ABI5轉(zhuǎn)錄因子缺失C端278個(gè)氨基酸時(shí)，它不能與MYB75、TT8和TTG1等調(diào)節(jié)蛋白相互作用。本研究還進(jìn)一步明確了ABI5轉(zhuǎn)錄因子與MYB75、MYB113和TTG1的N端以及TT8的C端相互作用。因此，本研究認(rèn)為ABA信號(hào)途徑中的bZIP類轉(zhuǎn)錄因子ABI5能與花青合成相關(guān)的MYB75、TT8及TTG1等蛋白相互作用形成復(fù)合物。將來通過詳細(xì)分析ABI5轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)的突變體或高表達(dá)轉(zhuǎn)基因植物有望進(jìn)一步明確ABI5轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控花青素合成的功能及可能的分子機(jī)理。本研究初步揭示了ABA信號(hào)途徑與花青素合成之間的內(nèi)在聯(lián)系，進(jìn)一步研究將揭示ABA誘導(dǎo)擬南芥幼苗花青素合成的調(diào)控機(jī)制。

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（責(zé)任編輯 周翠鳴）