趙紅艷, 王 嬌, 曹井國(guó), 楊宗政, 劉紅磊

(1. 天津科技大學(xué) 化工與材料學(xué)院， 天津 300457； 2. 天津科技大學(xué) 海洋與環(huán)境學(xué)院， 天津 300457； 3. 天津市環(huán)境保護(hù)科學(xué)研究院， 天津 300191)

由于水體富營(yíng)養(yǎng)化，藍(lán)藻水華導(dǎo)致嚴(yán)重的環(huán)境問(wèn)題，引起了世界的廣泛關(guān)注[1]。藍(lán)藻水華過(guò)程中伴隨著有機(jī)物厭氧分解，產(chǎn)生難聞的氣味，并使水體水質(zhì)變差[2]。一些藍(lán)藻還會(huì)釋放出藍(lán)藻毒素，危脅水生生物和人類的健康[3]?？刂扑{(lán)藻水華已經(jīng)成為環(huán)境保護(hù)迫切需要解決的問(wèn)題[1]。

近幾年，采用化感物質(zhì)作為殺藻劑已經(jīng)引起廣泛關(guān)注[4]，化感物質(zhì)已被證實(shí)是一種環(huán)境友好性的殺藻劑，它具有特異性和生物可降解性[5]。人們相繼開(kāi)展了化感抑藻研究，比如水稻提取物對(duì)銅綠微囊藻生長(zhǎng)的抑制作用研究[6]，大麥秸稈對(duì)藍(lán)藻化感作用與機(jī)理的研究[7]，臭椿提取物對(duì)銅綠微囊藻的抑制作用研究[8]，胡桃醌以及衍生物對(duì)銅綠微囊藻的抑制作用研究等[9]。中藥是化感物質(zhì)的資源寶庫(kù)，富含眾多化感成分，對(duì)中藥提取物抑藻研究也呈逐年增多的趨勢(shì)[10]。

大黃化學(xué)成分包括蒽醌類、吡喃酮類、苯丁酮類、萘苷類、?；擒疹悺⒍揭蚁╊?、鞣質(zhì)前體及鞣質(zhì)等，其中蒽醌類成分是大黃中一類重要活性成分，研究發(fā)現(xiàn)其有抗炎、抗腫瘤、保護(hù)心血管等廣泛的藥理作用[11-12]。大黃的化學(xué)成分比較復(fù)雜，本課題組在前期研究發(fā)現(xiàn)，中藥大黃提取物具有顯著抑藻效果。中藥大黃提取物對(duì)藻類具有抑制作用的可能為大黃素、大黃酸、大黃酚、大黃素甲醚和蘆薈大黃素等蒽醌類化合物[13]。

本文選用蘆薈大黃素作為抑藻劑，研究其對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)、光合系統(tǒng)、蛋白合成以及藻毒素的影響，揭示蘆薈大黃素抑制藍(lán)藻效果與機(jī)制，為進(jìn)一步對(duì)大黃有效化感物質(zhì)的鑒別和應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 藻類的培養(yǎng)

藻類的培養(yǎng)參考文獻(xiàn)[14]。蘆薈大黃素購(gòu)于四川省維克奇生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

將5 mL的濃度為50～200 mg/L蘆薈大黃素的標(biāo)品分別加入到150 mL銅綠微囊藻培養(yǎng)液(藻液初始濃度約為107cells/mL)中(對(duì)照組加入相同體積的DMSO溶液)，且每組設(shè)置3個(gè)平行樣。記錄藻液的初始密度和OD值(OD=680,紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，UV-2700)，每72 h測(cè)定1次。葉綠素a、類葫蘆卜素、藻膽蛋白和藻毒素的測(cè)定方法參照文獻(xiàn)[14]；可溶性蛋白的測(cè)定方法參照文獻(xiàn)[15]。

1.3 電鏡(SEM)

將細(xì)胞用5%的戊二醛固定2 h，用pH 7的磷酸緩沖溶液洗滌3次，用20%～100%的乙醇脫水，用叔丁醇置換樣品3 次，再用冷凍干燥機(jī)干燥12 h，鍍金。用掃描電鏡(SEM，SU1510)在30 kV下觀察銅綠微囊藻細(xì)胞顯微結(jié)構(gòu)的變化。

1.4 丙二醛、超氧化物歧化酶和過(guò)氧化氫酶的測(cè)定

丙二醛(MDA)含量通過(guò)硫代巴比內(nèi)酸比色法測(cè)定參考文獻(xiàn)[16]。超氧化物歧化酶(SOD)活性和過(guò)氧化氫按照試劑盒的說(shuō)明進(jìn)行測(cè)定。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

統(tǒng)計(jì)分析方法參見(jiàn)文獻(xiàn)[14]。

蘆薈大黃素對(duì)銅綠微囊藻生長(zhǎng)抑制率(IR)的計(jì)算公式如下：

IR(%)=(1-En/Cn)×100%

式中，En表示第n天實(shí)驗(yàn)組的藻密度；Cn表示第n天對(duì)照組的藻密度。

2 結(jié)果與討論

2.1 對(duì)銅綠微囊藻生長(zhǎng)的影響

蘆薈大黃素對(duì)銅綠微囊藻生長(zhǎng)的影響如圖1所示，可見(jiàn)蘆薈大黃素對(duì)銅綠微囊藻細(xì)胞的生長(zhǎng)均有抑制作用。與對(duì)照組相比，隨著濃度的增加和時(shí)間的延長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)組中OD值持續(xù)降低。各組培養(yǎng)液初始OD約為1.08，至12 d時(shí)，對(duì)照組中藻液的OD值為1.44；蘆薈大黃素濃度分別為50、100和200 mg/L，藻液中的OD值分別為1.223、0.337和0.299；抑制率分別為15%、80%和90%。

圖1 蘆薈大黃素對(duì)銅綠微囊藻生長(zhǎng)的影響

a：對(duì)照組；b、c和d： 50、100和200 mg/L

對(duì)12 d的藻細(xì)胞分別進(jìn)行掃描電鏡觀察，結(jié)果(圖2)顯示，正常藻細(xì)胞表面光滑，顆粒分布均勻，細(xì)胞接近球形。蘆薈大黃素濃度為50 mg/L時(shí)，大多數(shù)藻細(xì)胞通常是圓形的并且外部光滑，但是有的細(xì)胞出現(xiàn)褶皺，周圍分布著絮狀物(圖2-b)；蘆薈大黃素濃度為100和200 mg/L時(shí)，大多數(shù)的細(xì)胞形態(tài)不完整，細(xì)胞出現(xiàn)空洞，表面和周圍被內(nèi)溶物覆蓋(圖2-c、d)。這可能是由于化感物質(zhì)使細(xì)胞膜的通透性發(fā)生改變，細(xì)胞的內(nèi)含物大量滲出，甚至細(xì)胞膜整體破裂、溶解[17]，導(dǎo)致死亡。

2.2 對(duì)銅綠微囊藻中丙二醛含量的影響

分解產(chǎn)物MDA常被用作評(píng)估細(xì)胞氧化損傷的生物指標(biāo)[18]。測(cè)定MDA的積累可以反映機(jī)體脅迫損傷程度，特別是膜結(jié)構(gòu)的破壞程度[19]。銅綠微囊藻中MDA含量的變化結(jié)果(圖3)顯示，蘆薈大黃素能有效抑制銅綠微囊藻的生長(zhǎng)。隨著濃度的增加和時(shí)間的延長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)組中的MDA含量顯著增加。至12 d時(shí)，對(duì)照組中MDA的含量為0.0506 mg/L；蘆薈大黃素濃度分別為50、100和200 mg/L時(shí)，MDA的含量分別為0.0822、0.1122和0.1198 mg/L，與對(duì)照組相比，分別為是對(duì)照組的1.6倍、2.2倍和2.4倍。而對(duì)照組的MDA的含量保持相對(duì)穩(wěn)定。由此可見(jiàn)，經(jīng)不同濃度蘆薈大黃素處理的銅綠微囊藻細(xì)胞內(nèi)MDA的含量明顯增加，加劇了藻細(xì)胞的膜脂過(guò)氧化反應(yīng)，使細(xì)胞損傷嚴(yán)重，抑制了銅綠微囊藻的生長(zhǎng)。

圖3 蘆薈大黃素對(duì)銅綠微囊藻MDA含量的影響

2.3 對(duì)銅綠微囊藻光合系統(tǒng)的影響

蘆薈大黃素對(duì)葉綠素a和類胡蘿卜素的影響分別如圖4-A、B所示。

由圖4-A可知，至12 d時(shí)，對(duì)照組中的葉綠素a的含量為4.867 mg/L；蘆薈大黃素濃度分別為50、100和200 mg/L時(shí)，葉綠素a的含量分別為4.11、1.600和1.097 mg/L；抑制率分別為16%、67%和78%。由此可知，蘆薈大黃素濃度越大，對(duì)銅綠微囊藻中葉綠素a的抑制作用也越大。

A:葉綠素a；B:類胡蘿卜素

由圖4-B可知，至12 d時(shí)，對(duì)照組中的類胡蘿卜素的含量為1.083 mg/L；蘆薈大黃素濃度分別為50、100和200 mg/L時(shí)，類胡蘿卜素的含量分別為0.822、0.176和0.111 mg/L，抑制率分別為24%、84%和90%。由此可知，蘆薈大黃素濃度越高，對(duì)銅綠微囊藻中的類胡蘿卜素的抑制作用也越大。

葉綠素含量是光合速率測(cè)定中不可缺少的指標(biāo)，在光合作用過(guò)程中起著能量捕獲和轉(zhuǎn)移的重要作用[20]，葉綠素a是銅綠微囊藻中最主要的光合色素，也可以作為銅綠微囊藻中光合作用能力的監(jiān)測(cè)因子[21]，類胡蘿卜素具有吸收和傳遞光能的作用[22]。上述實(shí)驗(yàn)說(shuō)明，蘆薈大黃素破壞了藻細(xì)胞內(nèi)的光合色素葉綠素a和類胡蘿卜素，這與以前的研究結(jié)果一致[21]。本實(shí)驗(yàn)中的葉綠素a和類胡蘿卜素的降低可以證明蘆薈大黃素對(duì)銅綠微囊藻的光合作用的抑制作用，進(jìn)一步導(dǎo)致銅綠微囊藻細(xì)胞的正常生理代謝功能障礙。

A：藻藍(lán)蛋白；B：別藻藍(lán)蛋白；C：藻紅蛋白

藻膽蛋白是光合系統(tǒng)中重要的組成部分，具有吸收和傳遞能量的作用，蘆薈大黃素對(duì)藻藍(lán)蛋白、別藻藍(lán)蛋白、藻紅蛋白的影響分別如圖5所示。

由圖5-A可知，至12 d時(shí)，對(duì)照組中的藻藍(lán)蛋白的含量為0.033 58 mg/L；蘆薈大黃素濃度分別為50、100和200 mg/L時(shí)，藻藍(lán)蛋白的含量分別為0.027 49、0.000 80和0 mg/L；抑制率分別為20%、98%和100%。由此可知蘆薈大黃素濃度越高，對(duì)銅綠微囊藻中藻藍(lán)蛋白的抑制作用也越大。

由圖5-B可知，至12 d時(shí)，對(duì)照組中的別藻藍(lán)蛋白的含量為0.0161 mg/L，蘆薈大黃素濃度為50、100和200 mg/L時(shí)，別藻藍(lán)蛋白的含量分別為0.0120、0.0013和0.0009 mg/L，抑制率分別為25%、92%和95%。由此可知蘆薈大黃素濃度越高，對(duì)銅綠微囊藻中的別藻藍(lán)蛋白抑制作用也越大。

由圖5-C可知，至12 d時(shí)，對(duì)照組中的別藻藍(lán)蛋白的含量為0.0430 mg/L；蘆薈大黃素濃度分別為50、100和200 mg/L時(shí)，藻紅蛋白的含量分別為0.0360、0.0076和0.0048 mg/L；抑制率分別為17%、83%和89%。由此可知蘆薈大黃素濃度越高，對(duì)銅綠微囊藻中的藻紅蛋白抑制作用也越大。

藻膽體作為捕獲光能的功能單位，由藻膽蛋白(藻藍(lán)蛋白、別藻藍(lán)蛋白和藻紅蛋白)及連接蛋白構(gòu)成，排布在光合膜的表面，可以吸收460～670 nm波長(zhǎng)范圍的光，將吸收的能量傳到光合反應(yīng)膜上進(jìn)行光合作用。藻膽蛋白負(fù)責(zé)吸收光能，連接蛋白通過(guò)調(diào)整其組裝結(jié)構(gòu)及屬性，使能量傳遞達(dá)到最佳[23]，即光合系統(tǒng)Ⅱ(PSⅡ)，這3種藻膽蛋白是藍(lán)藻光合作用的主要功能團(tuán)[24]。藻膽蛋白含量的減少，導(dǎo)致銅綠微囊藻吸收的能量傳遞給葉綠素a時(shí)受阻，從而導(dǎo)致光合作用捕光能力下降，進(jìn)而抑制了藻類的光合作用[25]。結(jié)果表明：蘆薈大黃素破壞了光合作用中藻膽蛋白的結(jié)構(gòu)，使光合速率降低，進(jìn)而抑制藻膽蛋白的產(chǎn)生，會(huì)導(dǎo)致捕獲和吸收光的能力下降，抑制光合系統(tǒng)Ⅱ(SPⅡ)的活性。

2.4 對(duì)銅綠微囊藻中可溶性蛋白的影響

蛋白質(zhì)是藻細(xì)胞生命活動(dòng)的主要承擔(dān)者，細(xì)胞內(nèi)可溶性蛋白含量往往與細(xì)胞的代謝強(qiáng)度直接有關(guān)[5]?？扇苄缘鞍缀渴窃寮?xì)胞生理代謝功能的重要指標(biāo)[26]。蘆薈大黃素對(duì)可溶性蛋白的影響結(jié)果(圖6)顯示，蘆薈大黃素對(duì)銅綠微囊藻細(xì)胞中可溶性蛋白含量有抑制作用。與對(duì)照組相比，隨著濃度的增加和時(shí)間的延長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)組中可溶性蛋白含量持續(xù)降低。由圖6還可知，處理至12 d時(shí)，對(duì)照組中的可溶性蛋白的含量為110.2 mg/L；蘆薈大黃素濃度分別為50、100和200 mg/L時(shí)，可溶性蛋白的含量分別為89.1、39.3和30.5 mg/L；抑制率分別為20%、65%和73%。

圖6 蘆薈大黃素對(duì)銅綠微囊藻可溶性蛋白含量的影響

2.5 對(duì)銅綠微囊藻中超氧化物歧化酶(SOD)和過(guò)氧化氫酶(CAT)的影響

Alexova等[27]提出了銅綠微囊藻具有防御功能的酶系統(tǒng)，包括SOD、CAT和其它酶，通過(guò)消除過(guò)多的活性氧來(lái)保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷。蘆薈大黃素對(duì)銅綠微囊藻中SOD和CAT酶活性的影響如圖7所示。

A:SOD；B:CAT

由圖7-A可知，用蘆薈大黃素處理至12 d時(shí)，對(duì)照組中的SOD的含量為0.005 14 U/104cells；蘆薈大黃素濃度分別為50、100和200 mg/L時(shí)， SOD的活性分別為0.004 07、0.003 91和0.002 96 U/104cells，抑制率分別為23%、42%和62%。

由圖7-B可知，處理至12 d時(shí)，對(duì)照組中的CAT的含量為0.002 87 U/104cells；蘆薈大黃素濃度分別為50、100和200 mg/L時(shí)，CAT的活性分別為0.002 62、0.002 32和0.001 94 U/104cells，抑制率分別為10%、20%和33%。

2.6 對(duì)銅綠微囊藻藻毒素的影響

當(dāng)細(xì)胞壁被破壞時(shí)，藻毒素可能會(huì)從微囊藻中釋放[28]。藻毒素對(duì)生態(tài)及人體健康有害[29]。為了評(píng)估銅綠微囊藻細(xì)胞中的藻毒素釋放和毒素的降解，分析了蘆薈大黃素對(duì)銅綠微囊藻中的影響結(jié)果(圖8)顯示，蘆薈大黃素對(duì)銅綠微囊藻細(xì)胞中藻毒素含量有抑制作用，這與之前的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致[16]。與對(duì)照組相比，隨著暴露濃度和時(shí)間的延長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)組中藻毒素含量持續(xù)降低。由圖8還可知，在第9天時(shí)，對(duì)照組中的藻毒素的含量為1.0700 mg/L；蘆薈大黃素濃度分別為50、100和200 mg/L時(shí)，藻毒素含量分別為0.889、0和0 mg/L；抑制率分別為17%、100%和100%。這表明蘆薈大黃素在抑制藻細(xì)胞生長(zhǎng)的同時(shí)也可以抑制和降解藻毒素。

圖8 蘆薈大黃素對(duì)銅綠微囊藻中藻毒素的影響

3 結(jié)論

本研究表明蘆薈大黃素對(duì)銅綠微囊藻的生長(zhǎng)具有很好的抑制作用，蘆薈大黃素對(duì)細(xì)胞膜產(chǎn)生傷害，引起銅綠微囊藻細(xì)胞內(nèi)MDA 的含量顯著增加，造成藻細(xì)胞膜系統(tǒng)和功能紊亂；抑制銅綠微囊藻的葉綠素a等光合色素，阻遏其對(duì)光的捕獲及吸收，擾亂藻膽蛋白各組分的合成，從而降低銅綠微囊藻的光合作用；蘆薈大黃素也影響可溶性蛋白的合成，從而間接導(dǎo)致藻細(xì)胞正常生理代謝功能紊亂；蘆薈大黃素可以減輕或削弱抗氧化系酶( SOD、CAT) 的活性，進(jìn)而造成細(xì)胞的氧化損傷；蘆薈大黃素能顯著抑制藻毒素的產(chǎn)生，降低藻毒素的次生風(fēng)險(xiǎn)。本研究為尋找藍(lán)藻水華的有效化感制劑提供了新的來(lái)源。