劉梓燊，楊國旺

（1. 首都醫(yī)科大學附屬北京中醫(yī)醫(yī)院腫瘤科，北京100010；2. 首都醫(yī)科大學，北京100069）

肺癌是全球惡性腫瘤中最常見的一種，也是主要的致死癌種。據(jù)世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究中心(International Agency for Research on Cancer，IARC)在2018 年發(fā)布的GLOBOCAN 2018 文章中顯示，2018 年全球肺癌新發(fā)病例占惡性腫瘤新發(fā)病例的11.6%，死亡數(shù)目占18.4%［1］。中國衛(wèi)生健康統(tǒng)計年鑒收錄了三次中國惡性腫瘤死亡抽樣回顧調(diào)查，結(jié)果顯示肺癌的死亡率呈增長趨勢，現(xiàn)已居首位［2］。隨著醫(yī)學的發(fā)展和對疾病認識的深入，肺癌的治療方法逐漸豐富，西醫(yī)多采用手術(shù)、化療、放療、靶向、免疫等治療方法，但患者預(yù)后欠佳，5 年生存率低。中醫(yī)藥在惡性腫瘤的治療中應(yīng)用范圍廣，配合放化療、靶向治療、免疫治療等，可以增強治療效果、減輕毒副反應(yīng)、提高患者生存質(zhì)量、延長生存期等。

腫瘤患者的發(fā)病因素復(fù)雜，且疾病的發(fā)生發(fā)展需要一定的過程，“虛、瘀、毒”是其中重要的病因病機［3］，最后往往表現(xiàn)出虛實夾雜的癥狀。所以在治療方面，不能單獨針對實證應(yīng)用祛邪的方法，還需兼顧扶正，針對患者的病情，祛邪與扶正并用，相得益彰，達到更好的治療效果［4］。《素問·評熱病論》中記載：“邪之所湊，其氣必虛”。另外，在《醫(yī)宗必讀》中記載“積之成也，正氣不足而后邪氣踞之?！狈伟┗颊卟∥辉诜?，且久病傷氣，導(dǎo)致肺氣虛，往往會出現(xiàn)乏力、咳嗽、自汗等癥狀。肺氣虛弱，“子盜母氣”，導(dǎo)致脾氣虛，出現(xiàn)納差、大便溏等癥狀。故臨床上常采用補肺益脾的方法治療。一項關(guān)于原發(fā)性支氣管肺癌中醫(yī)證型與病理類型的相關(guān)性研究結(jié)果顯示，肺癌患者以虛證多見，中醫(yī)證型中比例最高為氣虛證占22.1%、其次為氣陰兩虛證占17.5%［5］。

我國現(xiàn)存最早的本草著作《神農(nóng)本草經(jīng)》中，將藥物分為上、中、下三品，黃芪和白術(shù)被列為上品［6］。黃芪歸脾、肺經(jīng)，具有補氣固表、生津養(yǎng)血等功效。白術(shù)歸脾胃經(jīng)，具有健脾益氣、止汗等功效，為“脾臟補氣健脾第一要藥?！卑仔g(shù)在補脾氣的同時，還能夠“培土生金”，補益肺氣。黃芪與白術(shù)相配伍，補益肺脾之氣較單味藥的力量更強，效果更好。一項基于關(guān)聯(lián)規(guī)則探索中醫(yī)藥治療晚期肺癌的辨證思路及用藥規(guī)律的研究結(jié)果表明，使用頻次居前三位的中藥是黃芪、麥冬、白術(shù)［7］。另有一項基于數(shù)據(jù)挖掘技術(shù)對肺癌的中醫(yī)藥治療進行分析，結(jié)果顯示在治療肺癌的處方中，黃芪使用頻率為91.67%，白術(shù)為84.37%［8］。可見肺癌患者的處方中，黃芪、白術(shù)的應(yīng)用廣泛。但目前針對“黃芪—白術(shù)”在肺癌的防治作用機制方面缺乏深入研究。

針對中藥多成分、多靶點、多途徑的特點，網(wǎng)絡(luò)藥理學的研究與其高度適配。為預(yù)測“黃芪—白術(shù)”在治療肺癌方面作用機制，本篇文章將通過網(wǎng)絡(luò)藥理學方法，對“黃芪—白術(shù)”的有效成分、作用靶點、蛋白互作、生物通路、信號通路進行研究，分析潛在的作用關(guān)系，為其今后的研究提供參考和理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 化學成分及化合物靶點的篩選

通過Traditional Chinese Medicine Systems Phar?macology Database and Analysis Platform (TCMSP)平臺(http：//tcmspw.com/tcmsp.php)，檢索黃芪、白術(shù)的全部化學成分，并通過調(diào)整藥代動力學參數(shù)(ADME)對化學成分進行篩選獲得活性成分，相關(guān)參數(shù)設(shè)置為：口服利用度(oral bioavailability，OB) ≥30，藥 物 相 似 性(drug?likeness，DL) ≥0.18。通過ADME 篩選后得到藥物活性成分，并基于TCMSP 數(shù)據(jù)庫篩選出活性成分的潛在作用靶點，通過Uniprot 數(shù)據(jù)庫(https：//www. uniprot.org/)對潛在作用靶點進行篩選和標準化命名，篩選條件為“reviewed” “homo sapiens”，標準化命名為基因名稱。

1.2 疾病相關(guān)基因的篩選

以“肺癌”為關(guān)鍵詞分別在“TTD”數(shù)據(jù)庫(http：//db. idrblab. net/ttd/)、DisGeNET 數(shù) 據(jù) 庫(https：//www. disgenet. org/)和“OMIM”數(shù)據(jù)庫(https：//www.omim.org/)進行檢索，查找肺癌相關(guān)基因，并刪除重復(fù)靶點。

1.3 成分靶點和疾病靶點的共同靶點的獲取

使用R 語言VennDiagram 擴展包，對1.1 的成分潛在靶點與1.2 的疾病靶點取交集得到共同靶點，并繪制Venn圖。

1.4 靶蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

通 過 STRING (Version 11.0) 數(shù) 據(jù) 庫(https：//string?db. org/)，對1.3 獲得的共同靶點進行分析，設(shè)置蛋白種類為“homo sapiens”，獲取靶蛋白相互作用數(shù)據(jù)，使用Cytoscape3.7.2 軟件對結(jié)果可視化。

1.5 GO生物過程富集分析與KEGG通路富集分析

利用R 軟件3.6.3 中的Bioconductor 相關(guān)數(shù)據(jù)包(http：//www. bioconductor. org/)對1.4 獲得的靶蛋白進行GO 生物過程富集分析和KEGG 通路富集分析，設(shè)置P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義，輸出結(jié)果并繪制氣泡圖。

2 結(jié) 果

2.1 “黃芪—白術(shù)”化學成分及潛在靶點

通過“TCMSP”數(shù)據(jù)庫共挖掘“黃芪—白術(shù)”中的全部化學成分，其中黃芪87 個，白術(shù)55 個。通過調(diào)整ADME 參數(shù)(OB≥30，DL≥0.18)，以及對靶點進行Uniprot 篩選和標準化命名并去重后，共篩選出活性成分共19 個(見表1)，潛在作用靶點180 個(見圖1)。圖中藍色節(jié)點為黃芪和白術(shù)，綠色節(jié)點為“黃芪—白術(shù)”的活性成分，橙色節(jié)點為“黃芪—白術(shù)”活性成分的潛在靶點，橙色的顏色越深，表明其度值越大，378 條邊代表活性成分與潛在靶點的相互作用關(guān)系。

2.2 疾病相關(guān)基因的篩選

以“肺癌”為關(guān)鍵詞分別在“TTD”數(shù)據(jù)庫、“DisGeNET”數(shù)據(jù)庫和“OMIM”數(shù)據(jù)庫進行檢索，查找肺癌相關(guān)基因，刪除重復(fù)數(shù)據(jù)后剩余650個疾病相關(guān)靶點。

2.3 成分靶點和疾病靶點的共同靶點的獲取

通過R 語言Venn Diagram，對180 個成分潛在靶點與650 個疾病靶點取交集，得到29 個共同靶點，這29 個共同靶點視為“黃芪—白術(shù)”治療肺癌的預(yù)測靶點(見圖2)。

2.4 靶蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將“2.3”下得到的29 個交集靶點導(dǎo)入STRING(Version 11.0)數(shù)據(jù)庫中進行分析，利用Cytoscape3.7.2 軟件對所獲取的靶蛋白相互作用數(shù)據(jù)進行PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建(見圖3)。共有29 個靶蛋白發(fā)生相互作用，靶點的degree 值越大則形狀越大，代表靶蛋白之間互相作用的邊共187條。在該蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)中平均度值為12.9，度值大于平均度值的靶點共12 個，將其從大到小排列，依次為：AKT1、 VEGFA、 EGFR、 ESR1、 CCND1、 IL6、PTGS2、ERBB2、CASP8、IL1B、CDKN1A、KDR，表明其在互作網(wǎng)絡(luò)中具有重要作用，可作為“黃芪—白術(shù)”藥對治療肺癌的重要預(yù)測靶點。

2.5 GO功能富集分析及KEGG信號通路富集分析

將29個預(yù)測靶點基因提交至R 軟件Bioconduc?tor 數(shù)據(jù)庫進行GO 功能富集分析，按照P＜0.05 進行篩選，其中涉及生物過程1 260 個(見圖4)，細胞組分12 個(見圖5)，分子功能32 個(見圖6)。從生物過程富集分析中，主要涉及活性氧代謝過程、多細胞生物穩(wěn)態(tài)、不同營養(yǎng)水平應(yīng)答反應(yīng)、外部刺激下的細胞應(yīng)答、類固醇激素反應(yīng)、凋亡信號通路的調(diào)控、上皮細胞增殖、氧化應(yīng)激反應(yīng)、T 細胞活化等。從細胞組分富集分析中，靶點主要集中在膜筏、膜微結(jié)構(gòu)域、膜區(qū)、囊腔、核染色質(zhì)等。從分子功能富集分析中，主要為蛋白磷酸酶結(jié)合、磷酸酶結(jié)合、抗氧化活性、泛素連接酶結(jié)合、泛素樣連接酶結(jié)合、跨膜受體酪氨酸激酶活性、跨膜受體激酶活性、整合素結(jié)合、酪氨酸激酶活性、生長因子受體結(jié)合等。

表1 “黃芪—白術(shù)”篩選出的活性成分Table 1 The active ingredients of"Astragalus membranaceus ?Atractylodes macrocephala koidz"

將29 個靶蛋白基因提交至R 軟件Bioconductor數(shù)據(jù)庫進行KEGG 信號通路富集分析，按照P＜0.05 進行篩選，其中涉及信號通路26 個(見圖7)。在信號通路富集分析，主要涉及PI3K?Akt 信號通路、粘著斑、EGFR 酪氨酸激酶抑制劑耐藥性、內(nèi)分泌抵抗、鉑類耐藥性、HIF?1 信號通路、MAPK 信號通路、細胞衰老、Rap1 信號通路、Ras信號通路等。

3 討 論

根據(jù)研究結(jié)果進行分析，“黃芪—白術(shù)”藥對中口服利用度最高的是黃芪中的活性成分MOL000378 7?O?甲基?異微凸劍葉莎醇，為74.69%，另外黃芪成分中的MOL000392 芒柄花黃素、 MOL000433 葉 酸、 MOL000380 (6aR，11aR)?9，10?二甲氧基?6a，11a?二氫?6H?苯并呋喃［3，2?c］鉻?3?醇以及白術(shù)中的活性成分MOL000022 14?乙?；?12?千里香酰?2E，8Z，10E?白術(shù)三醇的口服利用度排名前五，由此推測這些成分在口服“黃芪—白術(shù)”時起到重要的藥理學作用。

圖1 “藥對—化合物—靶點”的網(wǎng)絡(luò)模型Fig.1 Network model of"drug pair?compound?target"

圖2 “黃芪—白術(shù)”藥對成分潛在靶點與肺癌疾病靶點Venn圖Fig.2 Venn diagram of“Astragalus membranaceus ?Atractylodes macrocephala koidz”drug pair potential targets and lung cancer disease targets

對“藥對—化合物—靶點”網(wǎng)絡(luò)模型進行分析，度值大于等于10 的靶點有11 個，占57.9%，從高到低依次為：槲皮素、山奈酚、7?O?甲基?異微凸劍葉莎醇、芒柄花黃素、異鼠李素、3，9?di?O?methylnissolin、(6aR， 11aR) ?9， 10?dime?thoxy?6a，11a?dihydro?6H?benzofurano ［3，2?c］chromen?3?ol、常春藤皂苷元、毛蕊異黃酮、3β?乙酰氧基蒼術(shù)酮、熊竹素。其中度值最高的是槲皮素，為137，說明其能與137 個靶點發(fā)生相互作用。槲皮素對多種惡性腫瘤［9?11］的增殖有抑制作用。一項研究證實，槲皮素可誘導(dǎo)降低MMP?9 的活性，對NSCLC A549 的凋亡起到了重要作用［12］。山奈酚具有抗癌作用，有研究證實，山奈酚能抑制NSCLC A549細胞侵襲和遷移能力［13］。另有研究證實，山奈酚能夠抑制SCLC H446 細胞的增殖，并誘導(dǎo)細胞的凋亡［14］。相關(guān)研究證實，芒柄花黃素對NSCLC A549 細胞有抑制其增殖和誘導(dǎo)凋亡的作用［15］。相關(guān)研究證實，異鼠李素在體外和體內(nèi)試驗均有抗腫瘤增殖的作用，其作用機制與誘導(dǎo)的細胞凋亡有關(guān)［16］。毛蕊異黃酮是《中國藥典》里記載的黃芪含量測定成分，相關(guān)研究證實，毛蕊異黃酮可抑制肺癌細胞A549 細胞的增殖與轉(zhuǎn)移［17］。除此之外，黃芪甲苷也是黃芪含量測定成分，本次因口服利用度、藥物相似性小于篩選標準，故在篩選時排除，但是相關(guān)研究結(jié)果證實，黃芪甲苷也具有抗腫瘤作用［18］。白術(shù)活性成分中，靶點度值最高為3β?乙酰氧基蒼術(shù)酮，度值為13，其次為8?β?乙氧基白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ，度值為5，以及白術(shù)活性成分中口服利用度63.37%的14?乙?；?12?千里香酰?2E，8Z，10E?白術(shù)三醇，都屬于白術(shù)揮發(fā)油成分，相關(guān)研究證實，白術(shù)揮發(fā)油成分在抗腫瘤方面有一定的效果［19］。另外，在180 個預(yù)測靶點中，有70 個靶點與至少2 個及以上的化合物相關(guān)，占38.9%。推測“黃芪—白術(shù)”藥對發(fā)揮著復(fù)雜的成分及靶點作用。

圖3 靶蛋白蛋白互作網(wǎng)絡(luò)模型(PPI)Fig.3 PPI network of target proteins

圖4 “黃芪—白術(shù)”預(yù)測靶點基因生物過程富集分析Top20Fig.4 Enrichment analysis of biological processes of predicted target genes of“Astragalus membranaceus ?Atractylodes macrocephala koidz”Top20

通過分析靶蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)，度值大于平均度值的靶點共12個，從大到小前3位為：AKT1、VEGFA、EGFR。AKT 被認為是一種癌基因，AKT1 是AKT 的重要亞型，相關(guān)研究表明，AKT1在NSCLC中表達上調(diào)［20］。相關(guān)臨床研究結(jié)果證明，AKT1 在NSCLC 發(fā)生過程中起促癌作用［21］。Folk?man［22］提出“腫瘤生長和轉(zhuǎn)移依賴于新生血管生成”，為抗腫瘤血管生成藥物提供了理論基礎(chǔ)。VEGF 是常見的血管生成刺激因子，血管內(nèi)皮生長因子A(VEGFA)是VEGF 中的一種。相關(guān)研究結(jié)果顯示，NSCLC 患者癌組織VEGFA 陽性率高于癌旁組織［23］。VEGFA 與血管內(nèi)皮生長因子受體(VEGFR)中的VEGFR2(又稱KDR)參與調(diào)控血管生成，其主要是通過對ERK、PI3K/Akt 等通路的調(diào)控，從而誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細胞增殖［24］。目前針對抗血管生成藥物有大量的研究，比如臨床常用藥貝伐單抗可與VEGFA 結(jié)合，從而減少VEGFA 與受體結(jié)合，達到抑制血管生長的目的［25］。EGFR是上皮生長因子(EGF)細胞增殖和信號傳導(dǎo)的受體。研究表明，在許多實體腫瘤中存在EGFR 的高表達或異常表達［26］。異?；罨腅GFR 信號通路與腫瘤細胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移、細胞凋亡的抑制、血管生成均有關(guān)聯(lián)。目前臨床已有多種針對EGFR 及其相關(guān)信號通路的靶向藥物，但其耐藥性，仍是目前需要解決的問題。

圖5 “黃芪—白術(shù)”預(yù)測靶點基因細胞組分富集分析Fig.5 Enrichment analysis of cellular component of predicted target genes of“Astragalus membranaceus ?Atractylodes macrocephala koidz”

圖6 “黃芪—白術(shù)”預(yù)測靶點基因分子功能富集分析Top20Fig.6 Enrichment analysis of molecular function of predicted target genes of“Astragalus membranaceus ?Atractylodes macrocephala koidz”Top20

圖7 “黃芪—白術(shù)”預(yù)測靶點基因信號通路富集分析Top20Fig.7 Enrichment analysis of KEGG pathway of predicted target genes of“Astragalus membranaceus ?Atractylodes macrocephala koidz”Top20

通過生物功能富集分析，發(fā)現(xiàn)靶點參與了多項生物過程，其中活性氧(ROS)代謝功能涉及11 個靶點，度值最高。ROS 的積累易導(dǎo)致基因突變，從而增加細胞癌變的風險，考慮與其破壞DNA、蛋白質(zhì)等有關(guān)系［27］。部分學者認為適度增高的ROS 與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展有著密切聯(lián)系，包括參與腫瘤活化的初始階段、參與多階段的致癌過程、促進腫瘤細胞的惡性增殖、參與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移［28?29］。與此同時，相關(guān)研究證明高濃度的ROS 能夠做到阻滯細胞周期、誘導(dǎo)細胞的凋亡和壞死［30］。在臨床治療方面，部分化療藥物通過產(chǎn)生大量的ROS 殺傷腫瘤細胞，以達到治療目的。綜上，ROS 代謝功能的增高程度，對于腫瘤的發(fā)生發(fā)展有不同的結(jié)局，所以針對ROS 的調(diào)控在腫瘤治療方面非常關(guān)鍵。

在KEGG 信號通路富集分析中發(fā)現(xiàn)，“黃芪—白術(shù)”藥對涉及多種信號通路，其中PI3K?Akt 信號通路在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起到重要作用，PI3K/AKT 信號通路與促進細胞增殖、抑制細胞凋亡、促進腫瘤血管生成、促進腫瘤轉(zhuǎn)移、化療耐藥性等有關(guān)［31］。另還有研究證實，通過抑制PI3K/Akt 信號通路，能有效地逆轉(zhuǎn)肺癌細胞對于順鉑的耐藥［32］。為腫瘤治療提供了新的思路，針對PI3K/AKT 信號通路的抑制劑是近年的研究熱點。有研究表明，EGFR 在肺癌、胃癌、結(jié)腸癌等腫瘤中，存在過表達的現(xiàn)象。EGFR 的過表達會促進腫瘤的生成、腫瘤血管的生成，以及腫瘤的轉(zhuǎn)移。EGFR酪氨酸激酶抑制劑的靶向藥物，為腫瘤的治療提供了新的方向，但靶向治療在取得治療效果的同時，仍需面臨繼發(fā)性耐藥的問題。針對晚期NSCLC 存在EGFR 基因突變的患者，第一、二代EGFR 酪氨酸激酶抑制劑在治療6 至13 個月時出現(xiàn)繼發(fā)性耐藥，第三代則在治療9 至3 個月時出現(xiàn)繼發(fā)性耐藥［33］。延緩繼發(fā)性耐藥的時間，與患者的生存時間緊密相關(guān)。

通過網(wǎng)絡(luò)藥理學的預(yù)測分析，“黃芪—白術(shù)”藥對在治療肺癌的過程中涉及多活性成分、多靶點和多信號通路，為今后的研究提供了參考和思路，但網(wǎng)絡(luò)藥理學的預(yù)測分析仍存在不足，比如未涉及到用藥劑量、用藥時間、用藥劑型、藥物相互作用等，針對此方面的問題，還有待相關(guān)研究的進一步證實。