李來(lái)旭，劉鑫瑩、潘添博，李 睿

1.重慶永健生物制品有限公司，重慶市 400000；2.重慶市合川區(qū)合陽(yáng)城街道辦事處畜牧獸醫(yī)站，重慶市 400000；3.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，黑龍江哈爾濱 150000

桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)(BEVS)被廣泛用于疫苗開發(fā)及外源蛋白表達(dá)。BEVS 因其操作簡(jiǎn)便、安全性及適用于大規(guī)模生產(chǎn)等優(yōu)勢(shì), 具有極大的應(yīng)用前景。桿狀病毒表達(dá)的受體為昆蟲細(xì)胞，目前應(yīng)用較廣的細(xì)胞系為SF9 細(xì)胞。目前獸用疫苗領(lǐng)域針對(duì)豬圓環(huán)病毒、禽流感病毒、豬瘟病毒及雞新城疫病毒等多疫苗在SF9 細(xì)胞中表達(dá)，極大程度上緩解了畜牧業(yè)的養(yǎng)殖風(fēng)險(xiǎn)和生產(chǎn)成本。

本研究自菌種保藏中心引進(jìn)SF9 細(xì)胞系，進(jìn)行細(xì)胞生物學(xué)特性研究，為開展SF9 細(xì)胞系及及傳染性法氏囊VP2 疫苗的研究與開發(fā)提供細(xì)胞資源和理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞SF9 細(xì)胞，購(gòu)自美國(guó)菌種保藏中心ATCC。

1.1.2 試驗(yàn)試劑：SF9 無(wú)血清培養(yǎng)基，胎牛血清，DMSO 購(gòu)自美國(guó)gibco 公司；無(wú)菌培養(yǎng)基，重慶永健生物制品有限公司制備。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞傳代：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SF9 細(xì)胞，以900 r/min 離心5 min，棄去上清，用SF9 無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞密度為0.8×106個(gè)/mL 分裝到三角培養(yǎng)瓶中。培養(yǎng)轉(zhuǎn)速為150 r/min，置27 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 基礎(chǔ)細(xì)胞庫(kù)的建立 取生長(zhǎng)狀況良的好SF9細(xì)胞進(jìn)行離心，加入凍存液，吹打混勻細(xì)，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度為1.2×107個(gè)/mL，每只凍存管分裝1 mL。梯度凍存后放入-70 ℃冰箱過(guò)夜，放于液氮罐中保存。建立SF9 細(xì)胞的原始細(xì)胞庫(kù)。

1.2.2 細(xì)胞形態(tài) 在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中取樣，用倒置顯微鏡進(jìn)行觀察。

1.2.3 生長(zhǎng)曲線 用SF9 無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞密度為0.8×106個(gè)/mL 分裝到三角培養(yǎng)瓶中。培養(yǎng)轉(zhuǎn)速為150 r/min，置27 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每天取樣檢測(cè)細(xì)胞密度，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.2.4 純凈性檢測(cè) 按照2015 版《中國(guó)獸藥典》開展無(wú)菌、外源病毒和支原體檢驗(yàn)。

1.2.5 染色體分析 取SF9 細(xì)胞，處理后用姬姆薩染色液處理后顯微鏡觀察，取100 個(gè)處于分裂中期的細(xì)胞核進(jìn)行檢查，觀察染色體形狀及染色體數(shù)量。

1.2.6 細(xì)胞致瘤性試驗(yàn) 裸鼠分為3 組，每組5 只，分別接種SF9 細(xì)胞、Hela 細(xì)胞及MRC5 細(xì)胞。接種后逐日觀察有無(wú)結(jié)節(jié)或腫瘤形成。

2 結(jié)果

2.1 基礎(chǔ)細(xì)胞庫(kù)的建立

按上述方法凍存SF9 細(xì)胞，于液氮中保存。建立了SF9 細(xì)胞的基礎(chǔ)細(xì)胞庫(kù)，結(jié)果見表1。

表1 SF9 細(xì)胞基礎(chǔ)細(xì)胞庫(kù)的建立

2.2 細(xì)胞形態(tài)

SF9 細(xì)胞置顯微鏡下觀察結(jié)果見圖1，細(xì)胞均呈圓球形、胞體大小一致，邊緣干凈清晰，呈現(xiàn)較好的細(xì)胞懸浮生長(zhǎng)狀態(tài)。

圖1 SF9 細(xì)胞形態(tài)

2.3 生長(zhǎng)曲線

細(xì)胞呈S 型生長(zhǎng)曲線，培養(yǎng)48 h，細(xì)胞密度約為3.4×106個(gè)/mL，培養(yǎng)72 h，細(xì)胞最大密度為4.0×106個(gè)/mL。

2.4 純凈性檢驗(yàn)結(jié)果

按現(xiàn)行《中國(guó)獸藥典》開展檢驗(yàn)，SF9 細(xì)胞無(wú)菌、支原體及外源病毒檢測(cè)結(jié)果均為陰性，純凈性好。

2.5 染色體分析結(jié)果

SF9 細(xì)胞內(nèi)染色體數(shù)目較多，多為原點(diǎn)、短桿狀和橢圓桿狀。細(xì)胞的染色體條數(shù)主要分布在170 ～190 之間。SF9 細(xì)胞染色體數(shù)目呈正態(tài)分布，染色體異倍化的程度大體相同。

2.6 細(xì)胞致瘤性試驗(yàn)結(jié)果

結(jié)果見表2 及圖2，SF9 細(xì)胞組接種裸鼠，5/5裸鼠淋巴結(jié)無(wú)結(jié)節(jié)形成，Hela 細(xì)胞組5/5 出現(xiàn)明顯腫瘤，MRC5 組裸鼠均無(wú)結(jié)節(jié)形成。

表2 細(xì)胞致瘤性檢驗(yàn)結(jié)果

圖2 裸鼠致瘤性照片

3 結(jié)論

SF9 細(xì)胞作為桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)常用的細(xì)胞株之一，在亞單位疫苗制備及產(chǎn)品研發(fā)中發(fā)揮重要作用，因此研究其細(xì)胞生物學(xué)特性具有重要意義。