袁風(fēng)玲 賈淑慧 江 源

卵巢癌是一種常見的婦科腫瘤，美國癌癥協(xié)會統(tǒng)計，其發(fā)病率僅次于子宮癌及子宮頸癌，位于第3位，但其死亡率卻居婦科腫瘤的第1位[1]。隨著醫(yī)學(xué)臨床技術(shù)的不斷發(fā)展，外科及化療已明顯改善了卵巢癌患者的預(yù)后，但其總體5年生存率仍僅有45%，其中晚期卵巢癌患者的5年生存率只有30%，而早期卵巢患者的5年生存率在70%～90%。因此對卵巢癌患者進(jìn)行早期診斷及治療，有助于改善患者的預(yù)后[2]。近年來，免疫治療已成為一種新的治療方法，卵巢癌免疫逃逸機(jī)制與患者預(yù)后具有一定的相關(guān)性，其中T細(xì)胞活化不僅需要TCR-MHC抗原肽復(fù)合物提供第一信號，還需協(xié)同刺激分子提供的第二信號，而協(xié)同刺激分子通過以上信號對T細(xì)胞活化、增殖、免疫應(yīng)答生物學(xué)功能進(jìn)行調(diào)節(jié)，是治療腫瘤的主要靶點(diǎn)之一[3]。在免疫治療中關(guān)于程序性死亡因子受體及其配體(PD-1/PD-L1)的藥物對多種腫瘤具有較好療效，而PD-1是CD28/CTLA-4的家族成員，其配體有PD-L1及PD-L2，目前PD-L1及PD-L2的表達(dá)與卵巢癌的相關(guān)研究較少[4]，因此本文分析了卵巢癌組織中PD-L1及PD-L2的表達(dá)，并判斷了其對卵巢癌預(yù)后的預(yù)測價值，以為卵巢癌早期診斷選擇合適的診斷指標(biāo)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇我院2012年1月至2014年12月收治的58例卵巢癌石蠟包埋的組織標(biāo)本，癌組織均取自腫瘤的原發(fā)灶，隨訪資料完整；排除術(shù)前行化療、放療者?；颊吣挲g27～72歲，平均年齡為(55.1±4.5)歲，其中非漿液性囊腺癌者21例、漿液性囊腺癌者37例，腫瘤體積為3～5200 cm3，平均腫瘤體積為(1025.8±256.7) cm3，其中細(xì)胞分級低分化者35例、中高分化者23例，F(xiàn)IGO分期中Ⅰ期+Ⅱ期者13例、Ⅲ期+Ⅳ期者45例；發(fā)生轉(zhuǎn)移者56例。取同期行卵巢囊腫手術(shù)的組織標(biāo)本45例作為良性對照組，其患者年齡為26～71歲，平均年齡為(54.1±5.2)歲。2組患者的年齡等資料對比無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。所有患者均用電話、門診等方式進(jìn)行隨訪，生存期為從手術(shù)日期至患者死亡的日期。

1.2 方法

2組均用Elivision TM免疫組化方法進(jìn)行染色，先將石蠟切片置于烘箱中2 h，脫蠟至水，再用Ph7.4的PBS溶液沖洗3次，每次沖洗時間為3 min，取一定量的EDTA緩沖液置入微波盒中，加熱至沸騰后將脫蠟水化的組織切片置于耐高溫的切片架上，之后置入沸騰的緩沖液中處理10 min，再將微波盒取出，用流水進(jìn)行自然冷卻，之后取出玻片，用蒸餾水進(jìn)行沖洗，再用PBS液進(jìn)行沖洗，每張切片上滴上1滴3%的H2O2，于室溫下進(jìn)行孵育，切斷內(nèi)源性氧化物酶活動，之后再用PBS液沖洗，除去PBS液后每張切片滴加1滴PD-L1鼠抗人單克隆抗體及PD-L2鼠抗人單克隆抗體，稀釋比例為1∶800，在4 ℃下孵育，再用PBS液沖洗，去除PBS液，于每張切片加一滴聚合物增強(qiáng)劑，于室溫下進(jìn)行孵育，用PBS液沖洗且去除PBS液后，每張切片加1滴酶標(biāo)抗鼠/兔聚合物，孵育30 min后用PBS液沖洗，再去除PBS液后加1滴新鮮二氨基聯(lián)苯胺，于顯微鏡下進(jìn)行觀察，之后用蘇木精進(jìn)行復(fù)染，再用中性樹膠進(jìn)行封固、晾干；實(shí)驗(yàn)以PBS替代一抗作為陰性對照，之后讓2名病理科醫(yī)師進(jìn)行讀片。

1.3 觀察指標(biāo)及判斷標(biāo)準(zhǔn)

(1)對比PD-L1、PD-L2在卵巢癌及卵巢囊腫組織中的表達(dá)；(2)分析卵巢癌組織中PD-L1與PD-L2蛋白表達(dá)與卵巢癌病理參數(shù)的關(guān)系；(3)用Kaplan-Meier法分析卵巢癌組織中PD-L1與PD-L2與患者術(shù)后總生存期的關(guān)系。

PD-L1與PD-L2陽性的判斷標(biāo)準(zhǔn)：PD-L1、PD-L2陽性結(jié)果用Fromowitz半定量分級對細(xì)胞陽性比例及染色強(qiáng)度計分進(jìn)行判定，其中陽性細(xì)胞>80%為4分，>50%～80%為3分，>25%～50%為2分，10%～25%為1分；細(xì)胞染色強(qiáng)度中棕褐色為3分，棕黃色為2分，淡黃色為1分，無著色為0分；其中二者總分之和6～7分為+++，2～5分為+～++，0～1分為-；其中+～+++為陽性，-為陰性[3]。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 對比PD-L1、PD-L2在卵巢癌與卵巢囊腫組織中的表達(dá)

卵巢癌組織中PD-L1、PD-L2陽性表達(dá)率明顯高于卵巢囊腫(P<0.05)，見表1。

表1 對比PD-L1、PD-L2在卵巢癌與卵巢囊腫組織中的表達(dá)(例，%)

2.2 卵巢癌組織中PD-L1、PD-L2蛋白表達(dá)與卵巢癌臨床病理參數(shù)的相關(guān)性

PD-L1、PD-L2在卵巢癌組織中的表達(dá)與患者的年齡、FIGO分期有明顯相關(guān)性(P<0.05)，而與患者的細(xì)胞分級、腫瘤大小、腫瘤轉(zhuǎn)移不相關(guān)(P>0.05)，見表2。

2.3 卵巢癌組織中PD-L1、PD-L2表達(dá)與患者術(shù)后總生存期的關(guān)系

采用Kaplan-Meier法分析發(fā)現(xiàn)，卵巢癌患者PD-L1及PD-L2陰性表達(dá)患者的總生存期明顯高于陽性表達(dá)患者(P<0.05)，見表3。

表2 卵巢癌組織中PD-L1、PD-L2蛋白表達(dá)與卵巢癌臨床病理參數(shù)的相關(guān)性/例

表3 卵巢癌組織中PD-L1、PD-L2與患者術(shù)后總生存期月)

3 討論

卵巢癌的臨床病理類型較為復(fù)雜，包括卵巢黏液性囊腺癌、卵巢漿液性囊腺癌、透明細(xì)胞癌、卵巢子宮內(nèi)膜樣癌、未分化癌等[4]，因其位置較深，因此患者在早期無明顯癥狀，多不能檢查確診，隨著疾病進(jìn)展，待患者出現(xiàn)明顯癥狀檢查時已處于晚期，其中手術(shù)及術(shù)后輔以紫杉醇、順鉑聯(lián)合化療是常規(guī)的治療方案[5]，但化療容易產(chǎn)生耐藥性，采用手術(shù)方式不能完全根治，因此改善卵巢癌患者預(yù)后的關(guān)鍵在于提高卵巢癌患者的早期檢出率[6]，因此臨床上需研發(fā)靈敏度更高、特異性更高的基因與分子靶向診斷指標(biāo)。免疫治療是控制、殺傷腫瘤細(xì)胞的一種新治療方案，協(xié)同刺激分子可對T細(xì)胞的活化、增殖、免疫應(yīng)答等生物學(xué)功能進(jìn)行調(diào)節(jié)，是腫瘤治療的一個主要靶點(diǎn)[7]。腫瘤細(xì)胞中的PD-L1、PD-L2信號通路已成為惡性腫瘤治療的研究重點(diǎn)，因此本文分析了卵巢癌組織中PD-L1及PD-L2的表達(dá)對卵巢癌預(yù)后的判斷價值。

本文結(jié)果表明，PD-L1與PD-L2在對照組卵巢囊腫組織中均為陰性表達(dá)，PD-L1與PD-L2在卵巢癌組織中陽性表達(dá)率分別為48.3%與39.7%。卵巢癌組織中PD-L1、PD-L2陽性率明顯高于卵巢囊腫，PD-L1、PD-L2在卵巢癌組織中的表達(dá)與患者的年齡、FIGO分期有明顯相關(guān)性，而與患者的細(xì)胞分級、腫瘤大小、腫瘤轉(zhuǎn)移不相關(guān)。采用Kaplan-Meier法分析發(fā)現(xiàn)，卵巢癌患者PD-L1及PD-L2陰性表達(dá)患者的總生存期明顯高于陽性表達(dá)患者；表明PD-L1、PD-L2陽性表達(dá)與卵巢癌患者的生存期密切相關(guān)，主要是由于PD-L1多表達(dá)于活化的B細(xì)胞、T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞表面上[8]，其與PD-1結(jié)合可促使免疫逃逸，其陽性的腫瘤細(xì)胞與PD-1陽性T細(xì)胞結(jié)合后，可對T細(xì)胞增殖、分化進(jìn)行抑制，并誘導(dǎo)其凋亡、耗竭細(xì)胞能量，其對一些惡性腫瘤有一定的抗腫瘤效應(yīng)[9]。同時PD-L2受體是CD28家族的PD-1，其胞外區(qū)與PD-1的IgV樣進(jìn)行區(qū)域性結(jié)合，其結(jié)構(gòu)中的酪氨酸會發(fā)生磷酸化，募集蛋白酪氨酸磷酸酶-1，從其下游的Zeta鏈相關(guān)蛋白進(jìn)行去磷酸化，對PI3K/Akt激酶活性進(jìn)行下調(diào)，從而使得p56lck失活，避免其向T細(xì)胞內(nèi)傳遞免疫抑制信號，對激活T細(xì)胞進(jìn)行抑制[10-11]，從而刺激免疫抑制性細(xì)胞因子IL-10分泌，其異常會對T細(xì)胞功能進(jìn)行抑制，進(jìn)一步對T細(xì)胞凋亡進(jìn)行誘導(dǎo)，從而對抗腫瘤免疫反應(yīng)產(chǎn)生影響，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，因此PD-L1與PD-L2表達(dá)在卵巢癌與卵巢囊腫患者中會出現(xiàn)差異，也可用于卵巢癌預(yù)后的判斷[12-13]。

綜上所述，PD-L1及PD-L2可能參與卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展，可用于卵巢癌的診斷及預(yù)后分析，腫瘤細(xì)胞與腫瘤微環(huán)境的關(guān)系有待進(jìn)一步深度分析，從而更透徹地認(rèn)識PD-L1、PD-L2信號通路，為卵巢癌的診斷、治療提供新的思路。