周 娟 劉月合 王春佟

DNA 甲基化異常是重要的腫瘤表觀遺傳學(xué)特征[1-2]。DNA甲基化的建立和維持由 DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMTs) 催化發(fā)生并完成。哺乳動(dòng)物體內(nèi) DNMT 分為 3 個(gè)家族，分別是DNMT1、DNMT2 和 DNMT3 家族，其中 DNMT1 在細(xì)胞內(nèi)主要起維持甲基化的作用，DNMT3 主要起從頭甲基化的作用[3-4]。本實(shí)驗(yàn)采用免疫組化技術(shù)，檢測(cè) DNMT1 在卵巢癌組織及正常卵巢組織中的表達(dá)，并探討其與臨床分期及病理分級(jí)之間的關(guān)系；此外，在細(xì)胞水平檢測(cè)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1在卵巢癌中的表達(dá)及其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 組織標(biāo)本 收集我院住院手術(shù)切除的 31 例卵巢癌患者新鮮手術(shù)標(biāo)本，年齡30～70歲，中位數(shù)為 55歲。所有病例均接受卵巢癌腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)并經(jīng)術(shù)后病理證實(shí)為卵巢上皮性癌，術(shù)前均未予以放射和化學(xué)治療[5-6]。另收集正常卵巢組織15例(因子宮肌瘤及子宮腺肌癥行全子宮+雙附件手術(shù))，所有病例均經(jīng)術(shù)后病理證實(shí)為正常卵巢組織，標(biāo)本用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋、切片后免疫組化染色。

1.1.2 細(xì)胞 人卵巢癌細(xì)胞 SKOV3 由中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) SKOV3細(xì)胞復(fù)蘇后，使用含10%胎牛血清的改良型 RPMI 1640 培養(yǎng)基，于 37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將SKOV3細(xì)胞懸液種于6孔板中，待細(xì)胞貼壁且融合度為70%～90%。配制轉(zhuǎn)染試劑混合液(每孔)：轉(zhuǎn)染試劑 6 μl + 質(zhì)粒 2 μg(siRNA 15 μl)+無(wú)血清無(wú)雙抗 RPMI 1640 200 μl。冰上靜置20 min。逐孔棄去細(xì)胞原培養(yǎng)液，加入含10%血清的RPMI 1640培養(yǎng)基1.3 ml及轉(zhuǎn)染試劑混合液 200 μl。輕晃混勻后置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。72 h提取總蛋白備用。

1.2.3 主要試劑及儀器 RPMI 1640培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)自美國(guó) GIBCO 公司，DNMT1 過(guò)表達(dá)質(zhì)粒購(gòu)自美國(guó) ADDgene公司，DNMT1 siRNA 購(gòu)自廣州銳博公司，X-treme GENEsiRNA 轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自瑞士羅氏公司，CCK8檢測(cè)試劑盒由日本同仁化學(xué)研究所提供，DNMT1及β-actin抗體購(gòu)自美國(guó)Cell signaling公司，HRP標(biāo)記的免疫組化二抗試劑盒購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司，Transwell小室購(gòu)自美國(guó) Mil-lipore 公司[7-8]。

1.2.4 Western blot 檢測(cè) 抽提細(xì)胞總蛋白，各取40 μg蛋白，SDS-PAGE分離后轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，加入DNMT1單克隆抗體(1∶1 000) 或β-actin單克隆抗體(1∶1 000)，4 ℃孵育過(guò)夜，TBST洗膜 8 min×5 次，加入相應(yīng)的二抗(1∶2 000)，室溫孵育 2 h，TBST 洗膜8 min×5次。加入發(fā)光試劑ECL曝光。

1.2.5 Transwell 小室實(shí)驗(yàn) 先消化細(xì)胞，用無(wú)血清無(wú)雙抗RPMI 1640 培養(yǎng)基反復(fù)洗滌細(xì)胞 3 次，重懸細(xì)胞后計(jì)數(shù)，再用無(wú)血清無(wú)雙抗RPMI 1640培養(yǎng)基重懸，使細(xì)胞密度達(dá) 2 ×106/ml 以上。將Transwell小室放入24孔板內(nèi)，每個(gè)Transwell小室上室中懸空加入100 μl細(xì)胞懸液含細(xì)胞 1×105個(gè)。在Transwell小室的下室中加入500 μl含20%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基。37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育20 h或者24 h。用鑷子取出小室，移至另一含有500 μl 1×PBS的孔內(nèi)浸泡2～3 min，取出小室，用棉簽逐個(gè)小心擦去微孔膜上層細(xì)胞，如此用 PBS 洗 3 次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)采用(均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)表示，運(yùn)用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 22.0(Chicago，IL，USA) 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。2組之間差異比較采用獨(dú)立樣本雙側(cè)t檢驗(yàn)，2組之間構(gòu)成比比較采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01為差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 卵巢癌組織及正常卵巢組織中DNMT1的表達(dá)

免疫組化檢測(cè)31例卵巢癌組織及15例正常卵巢組織中DNMT1的表達(dá)，結(jié)果提示卵巢癌組織中 DNMT1陽(yáng)性率為83.9%(26/31)，顯著高于正常卵巢組織的20.0%(3/15)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=17.701，P<0.001)。

2.2 DNMT1表達(dá)與卵巢癌臨床病理特征的關(guān)系

DNMT1 表達(dá)與腫瘤的臨床分期、病理分級(jí)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)(表1)。

表1 DNMT1 表達(dá)與卵巢癌臨床病理特征的關(guān)系(例，%)

2.3 敲低 DNMT1 對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖及遷移能力的影響

在SKOV3細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染DNMT1 siRNA 敲低 DNMT1后，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明 DNMT1 蛋白水平明顯下降，CCK8 實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)敲低DNMT1后SKOV3的增殖能力下降，Transwell小室實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示敲低DNMT1后SKOV3遷移能力下降。

3 討論

DNMT 是一組含有高度保守-COOH 末端，結(jié)構(gòu)相似的一類蛋白質(zhì)，其中DNMT1 主要負(fù)責(zé)維持基因組甲基化狀態(tài)，對(duì)抑制人癌細(xì)胞中抑癌基因的表達(dá)有重要作用，其活性升高被認(rèn)為是腫瘤細(xì)胞早期分子改變的一個(gè)特征[9-10]。同時(shí)，DNMT1 在基因啟動(dòng)子的超甲基化中發(fā)揮關(guān)鍵作用，并與人類的惡性腫瘤癌變有關(guān)。隨著對(duì)表觀遺傳學(xué)及腫瘤發(fā)病機(jī)制研究的進(jìn)一步深入，人們逐漸認(rèn)識(shí)到表觀遺傳調(diào)控在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[11-12]。DNA 甲基化是表觀遺傳的一種，在腫瘤的進(jìn)程中扮演重要角色，腫瘤細(xì)胞中常發(fā)現(xiàn) DNA 整體的低甲基化以及特定區(qū)域的高甲基化，尤其是CpG島的高甲基化在腫瘤中意義重大。

有學(xué)者發(fā)現(xiàn)在膀胱癌組織中，DNMT1 水平顯著升高，與腫瘤抑制基因 DBCC R 1 的 CpG島啟動(dòng)子超甲基化有關(guān)。腫瘤抑制基因啟動(dòng)子區(qū)，通過(guò)甲基化作用抑制其表達(dá)[13]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)運(yùn)用 DNMT 抑制劑可逆轉(zhuǎn)抑癌基因高甲基化并激活抑癌基因表達(dá)，進(jìn)而抑制腫瘤。有報(bào)道發(fā)現(xiàn)DNMT抑制劑5-氮雜-2'-脫氧胞苷可激活抑癌基因 HmLh1 并導(dǎo)致子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞凋亡[14]。DNA 的甲基化與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。抑癌基因和修復(fù)基因的甲基化會(huì)引起抑癌基因的沉默和修復(fù)基因的失活，使得對(duì)腫瘤抑制的喪失和增加了基因的損傷。而原癌基因的低甲基化狀態(tài)會(huì)使異常細(xì)胞趨向無(wú)限制生長(zhǎng)，形成腫瘤，甚至在腫瘤進(jìn)展過(guò)程中促進(jìn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[15]。

本研究結(jié)果顯示，DNMT1 在卵巢癌組織中的陽(yáng)性率顯著高于正常卵巢組織，且其表達(dá)與臨床分期、病理分級(jí)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)，臨床分期越晚、病理分級(jí)越高、有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者DNMT1的陽(yáng)性率越高。在真核生物中，DNMT1 是維持 DNA 甲基化的關(guān)鍵酶，其表達(dá)與基因印記、細(xì)胞分化和發(fā)育、腫瘤形成等密切相關(guān)。已有研究證實(shí)，DNMT1 促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，這與我們的研究結(jié)果一致[16]。我們課題組之前的研究也發(fā)現(xiàn)，DNMT3A 促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)發(fā)生，進(jìn)而促進(jìn)卵巢侵襲和轉(zhuǎn)移，這提示我們甲基化在卵巢癌的發(fā)生發(fā)展中有重要的作用。

綜上所述，DNMT1 在卵巢癌組織中的陽(yáng)性率明顯高于正常卵巢組織，具有促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞增殖和遷移的作用，但是具體的作用機(jī)制仍需后續(xù)研究進(jìn)一步闡明。本研究為卵巢癌的靶向治療提供了新的研究思路。