王志斌 周智輝 劉 芳 賀伯偉 廖和和

大腸癌是常見的消化系統(tǒng)腫瘤，且近年來隨著飲食結(jié)構(gòu)及生活方式的改變，當(dāng)前該病在我國的發(fā)病率逐年增加[1]。大腸癌的預(yù)后比較差，可給患者的生活質(zhì)量及生命健康均構(gòu)成極大威脅[2]。而隨著腫瘤病理分期的增長、腫瘤的侵犯深度加深和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的發(fā)生，患者生存率逐漸下降[3-4]。隨著對大腸癌研究的深入，對大腸癌臨床病理特征的研究已經(jīng)不僅僅局限于簡單的單因素分析，還需要從其他因素進(jìn)行深入分析。絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)異常激活是惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要通路，鼠類肉瘤濾過性毒菌致癌同源體B(v-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B，BRAF)基因是RAS/RAF/MEK/ERK/MAPK通路重要的轉(zhuǎn)導(dǎo)因子，參與調(diào)控細(xì)胞生長、分化和凋亡等生物學(xué)事件[5-7]。在人類結(jié)直腸癌、甲狀腺癌、肝癌、胰腺癌、惡性黑色素瘤、肺癌等均存在不同比例的BRAF基因突變，因此檢測BRAF基因突變可能有助于篩選出對治療反應(yīng)最敏感的大腸癌人群[8-9]。當(dāng)前有研究也顯示BRAF基因突變是消化道腫瘤最常見也是最有特異性的基因改變，可能決定患者的臨床和病理表現(xiàn)[10-11]，但是在大腸癌中的應(yīng)用情況還無相關(guān)報(bào)道。本文具體探討了大腸癌BRAF基因突變與病理特征的相關(guān)性，希望為臨床工作提供經(jīng)驗(yàn)和借鑒?，F(xiàn)總結(jié)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 研究對象

研究得到了本院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，2016年2月至2019年5月選擇在本院診治的大腸癌患者118例與大腸腺瘤患者118例，納入標(biāo)準(zhǔn)：病理診斷證實(shí)為原發(fā)性大腸癌或大腸腺瘤；術(shù)前均未接受任何放化療等治療；臨床病理資料完整；無合并嚴(yán)重的心腦血管、肝腎肺等器官組織疾??；均自愿參加并簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：臨床病理資料缺乏者；合并其他類型惡性腫瘤；合并血液系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)或內(nèi)分泌系統(tǒng)嚴(yán)重疾病者；妊娠與哺乳期婦女。

大腸癌患者中男性67例，女性51例；平均年齡(56.20±5.21)歲；平均腫瘤直徑(4.82±0.78)cm；腫瘤部位：直腸45例，結(jié)腸73例；臨床分期：Ⅰ期47例，Ⅱ期13例，Ⅲ期58例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移45例，組織學(xué)分化：低分化23例，中分化82例，高分化13例；浸潤深度：T1+T2 32例，T3+T4 86例。大腸腺瘤患者中男性65例，女性53例；平均年齡(56.67±3.78)歲。兩組不同患者的性別、年齡等對比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

1.2 標(biāo)本采集

取所有患者的病灶組織樣本，均經(jīng)10%的甲醛溶液固定，制成石蠟包埋切片。提取組織的基因組DNA，采用上海生工有限公司生產(chǎn)的基因突變檢測試劑盒(實(shí)時(shí)熒光定量PCR探針法)提取組織的基因組DNA并進(jìn)行檢測，檢測儀器為Stratagene Mx3000P熒光PCR檢測儀。PCR擴(kuò)增條件：42 ℃ 5 min，94 ℃ 3 min；(94 ℃ 45 s；60 ℃ 45 s)40個(gè)循環(huán)，BRAF：目的基因Ct值<38為突變型。檢測引物由大連TAKAR有限公司設(shè)計(jì)及合成，正向序列為：5’-AGTATTACCAACCAGACTATCCT-3’，反向序列為：5’-TCATAATGCTTGGTCTGATAGGA-3’。

1.3 觀察指標(biāo)

調(diào)查所有患者的性別、年齡等資料，同時(shí)記錄大腸癌患者的臨床分期、分化程度、浸潤深度、腫瘤部位、腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理學(xué)特征。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法

應(yīng)用SPSS 19.00軟件對本研究所有數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)采用百分比、率等等表示，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行對比分析，計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)進(jìn)行對比分析，并采用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型進(jìn)行分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BRAF基因突變率對比

大腸癌患者的BRAF基因突變率為34.7%(41/118)，顯著高于大腸腺瘤患者的5.1%(6/118)(χ2=32.545，P<0.05)。

2.2 BRAF基因突變與臨床病理特征的關(guān)系

在大腸癌患者中，不同性別、年齡、腫瘤直徑、腫瘤部位、分化程度等患者的BRAF基因突變率對比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而不同浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期等患者的BRAF基因突變率對比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 BRAF基因突變與臨床病理特征的關(guān)系(例，%)

2.3 相關(guān)性分析

在大腸癌患者中，以BRAF基因突變作為因變量，以浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期作為自變量，Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型顯示浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期為導(dǎo)致BRAF基因突變的影響因素(P<0.05)。見表2。

表2 導(dǎo)致大腸癌BRAF基因突變的影響因素

3 討論

隨著世界人口的老齡化、飲食結(jié)構(gòu)的改變與經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，近年來大腸癌的發(fā)病率呈逐年上升趨勢，已經(jīng)成為危害我國人民生命健康的主要疾病之一[12]。而隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，對大腸癌的分子機(jī)制研究也不斷深入。BRAF基因又名鼠類肉瘤濾過性的毒菌致癌同源體B1，位于人染色體7q34，屬于絲氨酸-蘇氨酸蛋白質(zhì)激酶類[13]。BRAF基因?qū)儆趯費(fèi)APK通路中的分子之一，也是EGFR信號通路中的重要作用因子。BRAF基因突變能激活ERK信號，誘導(dǎo)細(xì)胞增殖，防止細(xì)胞凋亡。BRAF的主要突變位點(diǎn)是蛋白質(zhì)產(chǎn)物中第600位的賴氨酸(V)谷氨酸(E)所替代(V600E)，從而使絲氨酸-蘇氨酸蛋白質(zhì)激酶發(fā)生持續(xù)性活化，誘發(fā)癌變的形成[14-15]。本研究顯示大腸癌患者的BRAF基因突變率為34.7%，顯著高于大腸腺瘤的5.1%，表明大腸癌患者多伴隨有BRAF基因突變。

BRAF基因是EGFR下游信號通路中的重要信號傳導(dǎo)蛋白，對細(xì)胞的增殖等功能產(chǎn)生重要影響[16]。BRAF基因突變使細(xì)胞的生長擺脫EGFR信號通路的調(diào)控，從而可誘發(fā)腫瘤的形成[17]。本研究顯示在大腸癌患者中，不同性別、年齡、腫瘤直徑、腫瘤部位、分化程度等患者的BRAF基因突變率對比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而不同浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期等患者的BRAF基因突變率對比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。從機(jī)機(jī)制上分析，BRAF基因突變可激活細(xì)胞內(nèi)酪氨酸激酶蛋白活性，使酪氨酸發(fā)生磷酸化，激活Ras/MAPK等多種信號傳導(dǎo)途徑，當(dāng)信號傳導(dǎo)至細(xì)胞膜及細(xì)胞間質(zhì)時(shí)，導(dǎo)致細(xì)胞增殖失控，并抑制細(xì)胞凋亡發(fā)生，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞癌變[18-20]。

BRAF基因突變與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展等有關(guān)，也可能是1種新的惡性腫瘤相關(guān)基因治療靶點(diǎn)[21-22]。本研究Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型顯示浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期為導(dǎo)致BRAF基因突變的影響因素。原發(fā)腫瘤的浸潤深度超過漿膜者，腫瘤細(xì)胞容易發(fā)生轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致淋巴轉(zhuǎn)移和血行轉(zhuǎn)移，使得臨床分期增加，局部組織殘留不可見的腫瘤細(xì)胞的可能性增大，從而可影響B(tài)RAF基因突變情況[23-25]。本研究也有一定的不足，樣本的數(shù)量較少，BRAF基因突變位點(diǎn)分析比較少，將在下一步進(jìn)行深入分析。

總之，大腸癌BRAF基因突變率比較高，與患者的浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期等病理特征顯著相關(guān)。