鐘琳琳 鄒平安 婁 俊 王 超 胡愛民

宮頸癌原發(fā)于宮頸上皮組織，是婦科常見惡性腫瘤之一，其發(fā)病率在婦科腫瘤中僅次于乳腺癌，且近年來發(fā)病率呈不斷上升及年輕化趨勢。多西他賽聯(lián)合順鉑腎毒性及胃腸道反應(yīng)大，因此亟需尋找替代化療藥物。本研究擬以宮頸癌hela細胞為研究對象，通過MTT試驗及流式細胞儀檢測細胞凋亡情況，研究姜黃素是否能夠增強多西他賽對宮頸癌細胞增殖抑制作用。

1 材料與方法

1.1 材料

宮頸癌hela細胞株購自北京協(xié)和醫(yī)科大學(xué)生物細胞庫;F12型培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司;胎牛血清購自杭州四季青生物工程有限公司；胰蛋白酶凍干粉(含EDTA)購自美國Sigma公司;表阿霉素購自齊魯藥業(yè)公司,溶于滅菌去離子水中制備成10 mg/ml的母液,培養(yǎng)基稀釋成工作濃度,4 ℃儲存;DMSO及MTT購自美國Sigma公司,溶于二甲基亞砜(DMSO)中制備成50 mg/ml的母液，培養(yǎng)基稀釋成工作濃度(用培養(yǎng)基稀釋后工作液DMSO濃度<1%)，-20 ℃儲存。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) hela細胞貼壁生長于含10%胎牛血清的F12型培養(yǎng)液中，其中青霉素、鏈霉素各100 U/ml，于37 ℃、5%CO2的飽和濕度孵育箱中培養(yǎng)。細胞傳代后第3～5天，取對數(shù)生長期細胞進行實驗。

1.2.2 細胞增殖抑制實驗 調(diào)整細胞數(shù)為1×104/ml接種于無菌96孔培養(yǎng)板，每孔100 μl，繼續(xù)培養(yǎng)12 h，待細胞貼壁后，姜黃素單獨作用組分別給予含姜黃素濃度分別為20 μmol/ml,40 μmol/ml，60 μmol/ml，80 μmol/ml,100 μmol/ml的培養(yǎng)液200 μl；多西他賽單獨作用組分別給予含多西他賽濃度分別為多西他賽濃度分別為1 μg/ml,5 μg/ml，10 μg/ml,15 μg/ml，20 μg/ml的培養(yǎng)液200 μl。同時設(shè)立DMSO的陰性對照組、F12培養(yǎng)基空白對照組。每組每個濃度下設(shè)5個復(fù)孔，培養(yǎng)24 h后，每孔加入20 μl的MTT(5 mg/ml)，孵育4 h后，棄上清，加入DMSO，終止反應(yīng)。微振蕩5 min后，于酶標儀波長490 nm處測吸光度(A)。以上各組實驗重復(fù)3次。抑制率(%)=(1-實驗組A值/對照組A值)×100%。用細胞存活率對劑量對數(shù)作圖并按作圖法求出IC50值。選取2種藥物最小濃度以及兩種藥物最接近IC50且小于IC50的濃度做聯(lián)合實驗。(即選用20 μmol/ml姜黃素+1 μg/ml多西他賽以及40 μmol/ml姜黃素濃度+5 μg/ml多西他賽做聯(lián)合實驗)。采用Q值判斷姜黃素和多西他賽聯(lián)合用藥的性質(zhì)。Q=Ea+b/(Ea+Eb-Ea×Eb)。公式中Ea代表單藥A的抑制率，Eb代表單藥B的抑制率，Ea+b代表兩藥聯(lián)用的抑制率。Q值>1.15為兩藥協(xié)同作用，0.85≤Q≤1.15為相加作用，Q<0.85為拮抗作用。

1.2.3 流式細胞儀檢測細胞凋亡情況 選取2種藥物最小濃度以及兩種藥物最接近IC50且小于IC50的濃度做聯(lián)合實驗(即選用20 μmol/ml姜黃素+1 μg/ml多西他賽以及40 μmol/ml姜黃素濃度+5 μg/ml多西他賽做聯(lián)合實驗)，以等量的DMs0作對照，按照Annexin V-FITC/PI試劑盒廠家說明對細胞進行染色，檢測凋亡率。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 MTT試驗檢測藥物對細胞的抑制作用

在兩種藥物單獨作用下，hela細胞經(jīng)不同濃度姜黃素、多西他賽處理24 h后，細胞生長程度受到不同程度的抑制，且抑制程度依賴于藥物劑量的增加，其IC50分別為42.83 μmol/ml和6.18 μg/ml(圖1、2)。各實驗組與對照組抑制率比較差異有顯著性(P<0.05)。在聯(lián)合組中，hela細胞經(jīng)聯(lián)合藥物處理24 h后，細胞抑制率明顯增高；20 μmol/ml姜黃素+1 μg/ml多西他賽的聯(lián)合用藥組Q值=1.22,為協(xié)同作用；40 μmol/ml姜黃素濃度+5 μg/ml多西他賽的聯(lián)合用藥組Q值=0.93，為相加作用(表1)。

圖1 MTT檢測姜黃素對Hela細胞增殖抑制率

圖2 MTT檢測多西他賽對hela細胞增殖抑制率

表1 MTT檢測聯(lián)合藥物組對hela細胞增殖抑制率

2.2 流式細胞儀分析法檢測細胞凋亡結(jié)果

從圖3中可以看出，hela細胞分別經(jīng)20 μmol/ml姜黃素，1 μg/ml多西他賽及兩者聯(lián)合處理24 h，細胞凋亡率分別為(16.5±1.2)%、(14±0.9)%及(23.5±1.3)%，聯(lián)合組與單藥組細胞凋亡率間有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01)。hela細胞分別經(jīng)40 μmol/ml姜黃素，5 μg/ml多西他賽及兩者聯(lián)合處理24 h，細胞凋亡率分別為(20.1±1.1)%，(22.2±1.8)%及(43.2±3.3)%，聯(lián)合組與單藥組細胞凋亡率間有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01)。姜黃素能增強多西他賽對人宮頸癌細胞(hela)的凋亡效應(yīng)。

注：A為陰性對照組；B為20 μmol/ml姜黃素組；C為1 μg/ml多西他賽；D為20 μmol/ml姜黃素+1 μg/ml多西他賽組；E為40 μmol/ml姜黃素；F為5 μg/ml多西他賽組；G為40 μmol/ml姜黃素+5 μg/ml多西他賽組。

3 討論

多西他賽作為1種細胞生長抑制劑，與β微管蛋白亞蛋白能特異性結(jié)合，將細胞骨架蛋白的解聚阻斷，在有絲分裂期使微管不能形成紡錘體和紡錘體絲，從而使腫瘤細胞的分裂和繁殖阻止[1]。多西他賽聯(lián)合順鉑已成為宮頸癌的一線化療方案[2]。但順鉑腎毒性及胃腸道反應(yīng)大，因此亟需尋找替代化療藥物。

姜黃素是1種從姜黃科根莖類提取的多酚類類物質(zhì)[3]，具有廣泛的抗腫瘤作用。近年國內(nèi)外研究表明，姜黃素對口腔癌、胃癌、食管癌等多種癌細胞表現(xiàn)出較強的抑制作用[4-6]。王靜等的試驗證明姜黃素能通過降解Hsp90蛋白的機制，來抑制宮頸癌hela細胞的增殖[7]。姜黃素聯(lián)合順鉑 不但抑制宮頸癌 Hela細胞的增殖并誘導(dǎo)細胞凋亡，而且增加其敏感性，其機制可能與抑制p53基因表達有關(guān)[8]。多西他賽為傳統(tǒng)的宮頸癌化療藥物，療效確切，有研究證明，多西他賽單獨應(yīng)用時可對宮頸癌 Hela細胞產(chǎn)生抑制作用，與野生型p53基因聯(lián)用時，其藥物抑制作用增強[9]。

本實驗結(jié)果證實hela細胞經(jīng)不同濃度姜黃素、多西他賽處理24 h后，細胞生長程度受到不同程度的抑制，且抑制程度依賴于藥物劑量的增加。聯(lián)合用藥后，細胞抑制率明顯增高，Q值分別為1.22(20 μmol/ml姜黃素+1 μg/ml多西他賽)和0.93(40 μmol/ml姜黃素濃度+5 μg/ml淺藍菌素)，證明姜黃素能增強多西他賽對人宮頸癌細胞(hela)的抑制效應(yīng)。經(jīng)過流式細胞儀分析法，證實聯(lián)合組與單藥組細胞凋亡率之間有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01)。姜黃素能增強多西他賽對人宮頸癌細胞(hela)的及凋亡效應(yīng)。

本實驗只證實姜黃素能增強多西他賽對hela細胞抑制及凋亡作用，但其機制是否與抑制p53基因表達及活性有關(guān)，仍需進一步研究。