喬 柏 岳亞敏 宋美楠

乳腺癌是臨床常見的惡性腫瘤，99%為女性患病，其發(fā)生率呈逐年上升的趨勢。對于乳腺癌的治療，目前仍然是以手術(shù)為主要治療方法，輔助以放療和化療，但是部分患者預(yù)后不佳，5年生存率較低[1]。乳腺癌的致病機制尚未完全明確，但是研究認(rèn)為微小RNA(miRNA)在人體惡性腫瘤的發(fā)病中起到重要的作用[2]。MiR-382-5p被發(fā)現(xiàn)在乳腺癌中呈現(xiàn)低表達(dá)狀態(tài)，為了觀察其對乳腺癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響，我院進(jìn)行了本次研究，現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 患者選擇

選擇2018年1月至2018年12月至我院診斷為乳腺癌并的患者86例，所有患者均為女性，年齡31～77歲，平均年齡(47.82±10.33)歲；術(shù)后病理診斷浸潤性導(dǎo)管癌65例，原位癌11例，粘液癌7例，其他浸潤癌3例。本次研究報請醫(yī)院倫理委員會并予以批準(zhǔn)。

納入標(biāo)準(zhǔn)[3]：①經(jīng)術(shù)后病理檢查確定診斷。②術(shù)前未進(jìn)行過放療、化療的患者。③乳腺為原發(fā)病灶的患者。④患者對本次研究知情同意。

排除標(biāo)準(zhǔn)[4]：①未取得術(shù)中病理的患者。②乳腺部位的惡性腫瘤為轉(zhuǎn)移病灶的患者。③術(shù)前進(jìn)行過放化療治療的患者。④病例資料不完善的患者。⑤不同意參與本次研究的患者。

1.2 方法

1.2.1 取材 取患者乳腺癌組織0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm為觀察組，同時取與乳腺癌病灶間隔5 cm以上同樣大小的正常組織為對照組。標(biāo)本常規(guī)甲醛固定。

1.2.2 設(shè)備及試劑 產(chǎn)婦在進(jìn)行剖宮產(chǎn)手術(shù)后，將取出的胎盤進(jìn)行收集，選擇兩塊胎盤面積組織，重量為3 g，進(jìn)行剪膜和漂洗，將一塊胎盤放在溫度在-80 ℃環(huán)境中，準(zhǔn)備收集蛋白和RNA，將其余一塊胎盤制作成長1.5 cm、寬2 cm，高3 cm的組織，并放入10%的中性甲醛溶液中，8到24 h后取出，制作成蠟塊，存放于溫度在-20 ℃中的環(huán)境中，行RT-PCR、Western blot。

1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 使用含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基對MCR-10A、MDA-MB-231以及HEK293細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，使用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，在37 ℃、5%CO2以及飽和濕度的培養(yǎng)箱對BT-549、MCR-7細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。選擇對數(shù)生長期細(xì)胞作為轉(zhuǎn)染對象，對照組轉(zhuǎn)染miR-NC，觀察組轉(zhuǎn)染miR-382-5p，嚴(yán)格按照試劑盒要求進(jìn)行操作。

1.2.4 PT-PRC檢測 設(shè)備和試劑：Trizol購自美國Gibco BRL公司，Taq酶購自大連寶生物公司，模板RNA2 μg、M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶購自美國Promega公司。引物由上海生工生物工程公司合成。UVIpro凝膠圖像分析系統(tǒng)購自美國KODAK公司。

方法：將標(biāo)本通過Trizol方法提取組織總RNA，反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃ 1 min，68 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，共計29個循環(huán)，72 ℃延伸10 min。PCR反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)過1.5%瓊脂糖凝膠電泳60 min，使用UVIpro凝膠圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行攝像、掃描、分析。

1.2.5 Western blot法檢測蛋白表達(dá) 取30 μg蛋白，經(jīng)10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，轉(zhuǎn)至聚偏乙酰膜，在5%脫脂牛奶室溫條件下封閉2h，配置一抗NF90抗體、GAPDH抗體1∶10000,4 ℃下孵育過濾，緩沖液洗3次，辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫孵育2 h，增強型化學(xué)發(fā)光試劑下顯影，進(jìn)行圖像分析。

1.2.6 平板克隆試驗 在轉(zhuǎn)染48 h后對轉(zhuǎn)染想細(xì)胞進(jìn)行收集、重懸、計數(shù)，在6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中接種并培養(yǎng)10 d，使用PBS溶液浸洗2次，然后加1 ml甲醇進(jìn)行固定，15 min，棄去固定液，加結(jié)晶紫染液進(jìn)行10min染色，使用自來水進(jìn)行沖洗，在倒置顯微鏡下對至少50個細(xì)胞觀察，記錄集落細(xì)胞所形成的克隆數(shù)量。

1.2.7 CCK-8法檢測 使用CCK-8試劑盒檢測乳腺癌細(xì)胞活力，首先將對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行重懸，然后接種96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，在轉(zhuǎn)染后1～5 d分別向96孔板中加入CCK-8、10微升/孔，低速震蕩10 s，再積血培養(yǎng)2 h，酶標(biāo)儀檢測，并在450 nm部位記錄A值，繪制上肢曲線。

1.2.8 流式細(xì)胞術(shù) 將轉(zhuǎn)染48 h后的兩組細(xì)胞分別進(jìn)行收集，使用PBS溶液進(jìn)行次清晰，400 μl細(xì)胞結(jié)合液重懸細(xì)胞，分別加入5 μl Annexin V-FITC以及10 μl PI中，在4 ℃下避光反應(yīng)30 min，應(yīng)用流式細(xì)胞儀對結(jié)果進(jìn)行檢測，分析細(xì)胞凋亡率。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果

2.1 miR-382-5p在乳腺癌組織和癌旁組織中的表達(dá)

觀察組樣本miR-382-5p與對照組相比呈現(xiàn)顯著低表達(dá)，且具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)，見表1。

表1 miR-382-5p在乳腺癌組織和癌旁組織中的表達(dá)情況

2.2 轉(zhuǎn)染后的MCR-7細(xì)胞miR-382-5p和NF90表達(dá)

觀察組轉(zhuǎn)染后的MCR-7細(xì)胞miR-382-5p表達(dá)量高于對照組，且具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)，但觀察組細(xì)胞中NF90 mRNA較對照組明顯降低，且均具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)，見表2。

表2 轉(zhuǎn)染后的MCR-7細(xì)胞miR-382-5p和NF90表達(dá)情況

2.3 miR-382-5p對多種蛋白表達(dá)的影響

細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后， Western blot法檢測結(jié)果顯示：MCF-7細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-382-5p后NF90、Bcl-2蛋白表達(dá)觀察組較對照組明顯下調(diào)，p53、p21、Bax觀察組較對照組明顯上調(diào)，Cyclin E1蛋白無明顯變化，見圖1。

圖1 Western blot法檢測miR-382-5p對多種蛋白表達(dá)的影響

2.4 平板克隆試驗結(jié)果

觀察組患者克隆形成數(shù)低于對照組，細(xì)胞凋亡率高于對照組，且具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)，見表3。

2.5 miR-382-5p對乳腺癌細(xì)胞MCF-7活力影響

采用CCK法檢測不同時間點MCF-7細(xì)胞生長，在細(xì)胞生長第4、5天，觀察組細(xì)胞活力低于對照組，且具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)，細(xì)胞生長1、2、3天兩組細(xì)胞活力無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，見圖2。

2.6 miR-382-5p對乳腺癌細(xì)胞MCF-7凋亡的影響

經(jīng)過流式細(xì)胞術(shù)檢查，顯示MCF-7細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-382-5p后凋亡率高于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表3 兩組樣本平板克隆試驗結(jié)果比較

圖2 miR-382-5p對乳腺癌細(xì)胞MCF-7活力影響

3 討論

微小RNA(miRNA)是長約22nt的非編碼RNA，在生物界廣泛存在，從病毒到人類中皆有發(fā)現(xiàn)。miRNA能夠與mRNA相結(jié)合，起到阻斷蛋白編碼基因表達(dá)的作用，從而阻止蛋白編碼基因翻譯成為蛋白[5]。既往的研究認(rèn)為miRNA與結(jié)直腸癌具有密切的關(guān)系[6]。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的miRNA超過3000個，大部分在動物體內(nèi)的基因調(diào)控中起到重要的作用，是機體內(nèi)最為主要的基因表達(dá)調(diào)控因子之一[7]。有研究認(rèn)為人體內(nèi)超過66.67%的基因均接受某一個或者一組miRNA的調(diào)控[8]。

miR-382-5p是miRNA家族中的成員，研究發(fā)現(xiàn)其在多種類的腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中起到重要的調(diào)控作用[9]。有文獻(xiàn)報道，miR-382-5p表達(dá)水平與骨肉瘤復(fù)發(fā)率呈負(fù)相關(guān)，即miR-382-5p水平越好，骨肉瘤復(fù)發(fā)率越低[10]。此外，miR-382-5p在卵巢癌組織和細(xì)胞中表現(xiàn)出下調(diào)的趨勢，能夠抑制亂猜細(xì)胞的增殖，并在上皮間充質(zhì)化過程中起到重要的作用。在這一過程中miR-382-5p的靶標(biāo)為酪氨酸激酶孤兒受體1[11]。結(jié)直腸癌中miR-382-5p也出現(xiàn)明顯的表達(dá)下調(diào)，與3’UTR直接結(jié)合后具有阻礙結(jié)直腸癌細(xì)胞生長、侵襲的作用。miR-382-5p與食道癌預(yù)后密切相關(guān)，其表達(dá)越低，食管癌預(yù)后越差[12]。在非小細(xì)胞肺癌中miR-382-5p出現(xiàn)明顯下調(diào)，其直接靶標(biāo)為SETD8。但是miR-382-5p在乳腺癌中的作用相關(guān)文獻(xiàn)報道較少。

本次研究選擇了86例乳腺癌患者病理標(biāo)本進(jìn)行臨床研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)觀察組樣本miR-382-5p與對照組相比呈現(xiàn)顯著低表達(dá)，且具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)，說明在乳腺癌組織中miR-382-5p的表達(dá)量降低，對癌細(xì)胞的調(diào)控能力減弱。從轉(zhuǎn)染上看，觀察組轉(zhuǎn)染后的MCR-7細(xì)胞miR-382-5p表達(dá)量高于對照組，但觀察組細(xì)胞中NF90 mRNA較對照組明顯降低，細(xì)胞轉(zhuǎn)染48h后， Western blot法檢測結(jié)果顯示MCF-7細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-382-5p后NF90、Bcl-2蛋白表達(dá)觀察組較對照組明顯下調(diào)，p53、p21、Bax觀察組較對照組明顯上調(diào)，Cyclin E1蛋白無明顯變化，說明miR-382-5p具有抑制癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移和分化的能力。觀察組患者克隆形成數(shù)低于對照組，細(xì)胞凋亡率高于對照組，且具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)，采用CCK法檢測不同時間點MCF-7細(xì)胞生長，在細(xì)胞生長第4、5天，觀察組細(xì)胞活力低于對照組，且具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)，說明miR-382-5p具有抑制腫瘤細(xì)胞生長的作用。細(xì)胞生長1、2、3天兩組細(xì)胞活力無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，經(jīng)過流式細(xì)胞術(shù)檢查，顯示MCF-7細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-382-5p后凋亡率高于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。說明miR-382-5p具有調(diào)控腫瘤細(xì)胞凋亡的作用，因此miR-382-5p在乳腺癌的增殖和凋亡中具有重要作用，能夠抑制細(xì)胞的增殖能力，進(jìn)一步提示miR-382-5p在乳腺癌中起到抑癌基因的作用，因此考慮乳腺癌的發(fā)生發(fā)展與miR-382-5p的表達(dá)缺失具有相關(guān)性[13]。

綜上所述，miR-382-5p具有抑制乳腺癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用，其基因與靶向抑制NF90基因具有相關(guān)性。miR-382-5p的作用機制可能與靶向作用核因子蛋白90相關(guān)，因此，miR-382-5p在癌組織中出現(xiàn)明顯的表達(dá)下調(diào)，這提示miR-382-5p的研究為乳腺癌的診斷和治療提供了新的途徑。但是本次研究的臨床樣本量較小，且乳腺癌具有高度的異質(zhì)性，因此應(yīng)該進(jìn)一步研究不同類型的乳腺癌中miR-382-5p水平的表達(dá)差異，為miR-382-5p在乳腺癌的診斷和治療中提供可靠數(shù)據(jù)。