許哲鑫 楊巨亮 王位坐

垂體瘤占所有顱內(nèi)腫瘤的15 %左右，當(dāng)前在我國(guó)的發(fā)病率逐年上升并年輕化[1-2]。不過依然有部分垂體瘤存在一定的侵襲性，可導(dǎo)致周圍結(jié)構(gòu)浸潤(rùn)，導(dǎo)致預(yù)后變差[3]。當(dāng)前炎癥與腫瘤之間的關(guān)系已被廣泛研究證實(shí)，接近20 %的機(jī)體腫瘤是由感染導(dǎo)致的慢性炎癥產(chǎn)生[4-5]。白介素-6(Interleukin-6，IL-6)為臨床上常見的炎癥因子，在垂體腺瘤發(fā)生發(fā)展中起著重要作用[6]。并且IL-6也是炎癥信號(hào)放大的關(guān)鍵結(jié)點(diǎn)，其調(diào)節(jié)基因包括細(xì)胞因子、絲氨酸蛋白酶、粘附分子等，均已證實(shí)與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)[7]。同時(shí)IL-6可與多TLR家族成員結(jié)合，可參與調(diào)節(jié)JNK等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活，具有調(diào)節(jié)腫瘤和正常細(xì)胞的凋亡等功能[8-9]。細(xì)胞自噬又被稱為Ⅱ型細(xì)胞死亡，通過溶酶體來吞噬蛋白質(zhì)、細(xì)胞器，從而造成細(xì)胞死亡[10-11]。本文具體探討了IL-6對(duì)垂體瘤細(xì)胞的增殖、凋亡和自噬的影響，以明確IL-6的作用效果與價(jià)值。現(xiàn)總結(jié)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 研究材料

大鼠垂體瘤細(xì)胞株GH3購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞資源中心，RPMI1640培養(yǎng)基購(gòu)自英國(guó)Abcam公司，PCR引物、PCR試劑盒由日本Takara公司提供，抗LC3-Ⅱ抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司，HRP 標(biāo)記羊抗兔二抗購(gòu)自中杉金橋公司。

1.2 細(xì)胞分組與處理

將GH3細(xì)胞加入含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)到70 %～80 %時(shí)，按1∶2～1∶4進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

將細(xì)胞分為對(duì)照組、siR-IL-6組與siR-siR-NC組，siR-IL-6組與siR-NC組分別轉(zhuǎn)染(Invitrogen Lipofectamine 3000 轉(zhuǎn)染試劑盒)20 nmol/L的siR-IL-6質(zhì)粒與siR-siR-NC質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染后6 h后更換常規(guī)培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。對(duì)照組不進(jìn)行轉(zhuǎn)染，以等體積的PBS代替。

siR-IL-6正向序列：5'GCAGGAUUCAACUCCAUUUdTdT-3'，反向序列：5'-AAAAUGGAGUUGAAUCCUGCTdTdT-3'。

1.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖指數(shù)

收集各組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，按5×103孔接種置于96孔板中，取5 mg/ml的MTT溶液20 μl加入每個(gè)細(xì)胞孔中，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。加入DMSO 200 μl充分溶解細(xì)胞內(nèi)結(jié)晶，用上酶標(biāo)儀于570 nm處檢測(cè)個(gè)孔吸光度(記錄OD)值，計(jì)算細(xì)胞增殖指數(shù)。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡指數(shù)

取數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞加入置于6孔板中，胰酶消化后留細(xì)胞，結(jié)合使用孵育緩沖液洗滌2次，離心去上清留細(xì)胞。加入結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，加入20 μl FITC Annexin Ⅴ和5 μl PI混勻，避光孵育20 min。1 000 r/min離心5 min，去上清，使用孵育緩沖液清洗1次，在1 h內(nèi)進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析，記錄細(xì)胞凋亡指數(shù)。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期

收集各組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的GH3細(xì)胞，置于6孔板中，離心后留細(xì)胞去上清，PBS清洗細(xì)胞3次。加入1 mg/ml RNaseA 2 μl濃度為1 mg/ml的RNaseA，37 ℃水浴40 min。然后加入10 μl FITC Annexin Ⅴ和5 μl PI，室溫下避光孵育20 min。離心去上清留細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)測(cè)定各周期細(xì)胞周期細(xì)胞所占比例。

1.6 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)

收集各組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，加入裂解液裂解細(xì)胞后，離心收集上清液，采用BCA法測(cè)定蛋白濃度，上樣SDS-PAGE膠，采用加入1∶1 000 的抗LC3-Ⅱ抗體、抗GAPDH抗體4℃孵育過夜，TBST洗滌后加入1∶5000二抗IgG室溫孵育1 h，TBST洗滌后以GAPDH內(nèi)參蛋白作為內(nèi)參照，將膜置于Imaging System化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)進(jìn)行自動(dòng)曝光，以目的蛋白與內(nèi)參蛋白照GAPDH的測(cè)定的結(jié)果灰度值之比表示目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行比較。上述每項(xiàng)實(shí)驗(yàn)都重復(fù)3次，取平均值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞增殖指數(shù)對(duì)比

轉(zhuǎn)染后24 h與36 h，siR-IL-6組的細(xì)胞增殖指數(shù)顯著低于siR-NC組與對(duì)照組(P<0.05)，siR-NC組與對(duì)照組對(duì)比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 三組轉(zhuǎn)染后不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞增殖指數(shù)對(duì)比

2.2 細(xì)胞凋亡指數(shù)對(duì)比

轉(zhuǎn)染后24 h與36 h，siR-IL-6組的細(xì)胞凋亡指數(shù)顯著高于siR-NC組與對(duì)照組(P<0.05)，siR-NC組與對(duì)照組對(duì)比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

表2 三組轉(zhuǎn)染后不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞凋亡指數(shù)對(duì)比

2.3 細(xì)胞周期對(duì)比

轉(zhuǎn)染后36 h，siR-IL-6組的G1期細(xì)胞比例顯著高于siR-NC組與對(duì)照組(P<0.05)，S期細(xì)胞比例顯著低于siR-NC組與對(duì)照組(P<0.05)，siR-NC組與對(duì)照組對(duì)比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表3。

表3 三組轉(zhuǎn)染后36 h的細(xì)胞周期

2.4 LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)水平對(duì)比

轉(zhuǎn)染后24 h與36 h，siR-IL-6組的LC3-Ⅱ蛋白相對(duì)表達(dá)水平顯著高于siR-NC組與對(duì)照組(P<0.05)，siR-NC組與對(duì)照組對(duì)比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表4。

表4 三組轉(zhuǎn)染后不同時(shí)間點(diǎn)的LC3-Ⅱ蛋白相對(duì)表達(dá)水平對(duì)比

3 討論

當(dāng)前已有多個(gè)生物學(xué)特征通常用于垂體瘤的診治以及預(yù)后評(píng)估，包括組織學(xué)分級(jí)、淋巴結(jié)受累等，但是很多患者有相似的生物學(xué)特征卻有顯著不同的臨床預(yù)后，尋找新的方法用于垂體瘤的早期診治與預(yù)后預(yù)測(cè)就具有重要價(jià)值[12-13]。

IL-6是1種具有多功能自分泌或旁分泌的生長(zhǎng)因子，對(duì)腫瘤細(xì)胞起著刺激增殖和抑制分化的雙向調(diào)節(jié)作用[14]。IL-6是gp130家族中重要的信號(hào)蛋白，主要由垂體前葉濾泡星形細(xì)胞生成[15]。IL-6到達(dá)垂體細(xì)胞不只依靠血循環(huán)，垂體細(xì)胞自身也可釋放IL-6，從而致垂體細(xì)胞生長(zhǎng)阻滯、激素分泌減少[16]。不過不同信號(hào)通路的激活或抑制IL-6/gp130復(fù)合物結(jié)合，會(huì)導(dǎo)致IL-6在正常組織和垂體瘤組織中不同的影響。并且IL-6還能夠刺激血管生成促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，抑制腫瘤細(xì)胞凋亡，刺激遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥性[17]。本研究顯示轉(zhuǎn)染后24 h與36 h，siR-IL-6組的細(xì)胞增殖指數(shù)顯著低于siR-NC組與對(duì)照組，siR-NC組與對(duì)照組對(duì)比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；轉(zhuǎn)染后36 h，siR-IL-6組的G1期細(xì)胞比例顯著高于siR-NC組與對(duì)照組，S期細(xì)胞比例顯著低于siR-NC組與對(duì)照組，siR-NC組與對(duì)照組對(duì)比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明抑制IL-6的表達(dá)能調(diào)節(jié)垂體瘤細(xì)胞周期，從而抑制垂體瘤細(xì)胞的增殖。

在當(dāng)前垂體瘤的發(fā)展機(jī)制研究中，多是從垂體瘤自身基因、翻譯蛋白異常、染色體變化，轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后修飾等多個(gè)層面進(jìn)行研究分析[18]。在不同類型的惡性腫瘤中，IL-6發(fā)揮作用及表達(dá)水平不盡相同，可發(fā)揮抑癌或促癌作用，還可從其特異性的角度出發(fā)進(jìn)行相應(yīng)的調(diào)控，從而對(duì)上下游相關(guān)蛋白進(jìn)行反饋調(diào)節(jié)[19-20]。本研究顯示轉(zhuǎn)染后24 h與36 h，siR-IL-6組的細(xì)胞凋亡指數(shù)顯著高于siR-NC組與對(duì)照組，siR-NC組與對(duì)照組對(duì)比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明抑制IL-6的表達(dá)能促進(jìn)垂體瘤細(xì)胞的凋亡。當(dāng)前研究顯示IL-6可通過AKT蛋白影響肺癌細(xì)胞下游PI3K/AKT/mTOR通路，對(duì)下游因子產(chǎn)生抑制作用，從而有利于細(xì)胞凋亡[21-22]。

LC3-Ⅱ是自噬體形成過程中的關(guān)鍵分子，其表達(dá)水平能夠直接反應(yīng)自噬的活力[23]。而腫瘤的腫瘤微環(huán)境存在差異，可導(dǎo)致自噬產(chǎn)生和自噬繞過，早期產(chǎn)生的自噬是對(duì)腫瘤增殖及惡化的限制和調(diào)整，分泌過多的IL-6就是機(jī)體對(duì)自噬的1個(gè)適應(yīng)調(diào)整機(jī)制[24]。本研究顯示轉(zhuǎn)染后24 h與36 h，siR-IL-6組的LC3-Ⅱ蛋白相對(duì)表達(dá)水平顯著高于siR-NC組與對(duì)照組，siR-NC組與對(duì)照組對(duì)比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明抑制IL-6的表達(dá)能促進(jìn)細(xì)胞自噬。本研究也有一定的不足，IL-6在乳腺癌中的靶基因是否是LC3-Ⅱ還不明確，且具體的作用機(jī)制還不明確，特別是IL-6的功能研究也不能脫離具體環(huán)境。

總之，在垂體瘤細(xì)胞中抑制IL-6表達(dá)能促進(jìn)細(xì)胞凋亡與自噬，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，從而抑制細(xì)胞增殖。