胡 駿，張俊溢，劉雯君，黃文霞

(1.廈門大學(xué)附屬中山醫(yī)院口腔科，福建 廈門 361000；2.廈門市第五醫(yī)院口腔科，福建 廈門 361000；3.廈門醫(yī)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院種植2科，福建 廈門 361000；4.廈門醫(yī)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院牙周科，福建 廈門 361000)

正畸矯治過程中，溫和而持續(xù)的矯治力作用于牙體，使牙槽骨改建，引起牙齒移動。牙齒移動正是在成骨細(xì)胞的骨形成與破骨細(xì)胞的骨吸收這樣一個成骨—破骨的動態(tài)平衡中進行[1]。牙周膜細(xì)胞、成骨細(xì)胞以及破骨細(xì)胞等多種細(xì)胞參與牙槽骨的動態(tài)平衡改建[2]。成骨細(xì)胞是骨形成和骨改建中重要的功能細(xì)胞，成骨細(xì)胞增殖及分化能力直接影響到牙槽骨的改建過程。在機械壓力的刺激作用下，成骨細(xì)胞內(nèi)多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路被激活，參與調(diào)節(jié)牙槽骨代謝與改建[2]。骨形成蛋白-4屬于骨形成蛋白家族和TGF-β家族，通過調(diào)控成骨細(xì)胞生長增殖、分化、遷移及凋亡能力，對軟骨及骨的形成與修復(fù)具有重要的誘導(dǎo)作用[3]。本文探討重組人骨形成蛋白-4(recombinant human bone morphogenetic protein-4，rhBMP-4)對體外培養(yǎng)的人成骨樣細(xì)胞MG-63 的增殖和分化活性的影響，為臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑及儀器

含10%胎牛血清的DMEM 高糖培養(yǎng)基(武漢普諾賽生命科技有限公司)；MTT(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；堿性磷酸酶測定試劑盒、羥脯氨酸測定試劑盒(南京建成生物工程研究所有限公司)；二甲基亞砜(美國Merck 公司)、Triton X-100(美國Sigma 公司)；ELx800UV 酶聯(lián)免疫檢測儀(美國BioTek公司)。

1.2 細(xì)胞株及其培養(yǎng)

人成骨樣細(xì)胞系MG-63 由中國典型培養(yǎng)物保藏中心提供，用含10%胎牛血清的DMEM 高糖培養(yǎng)基，培養(yǎng)在體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中，平均2 d更換1次培養(yǎng)液，每隔3～4 d進行1次細(xì)胞傳代。

1.3 MTT比色法測定細(xì)胞增殖率

用胰酶消化法將對數(shù)生長期MG-63 細(xì)胞制成6×104個/mL 細(xì)胞濃度的細(xì)胞懸液，每孔100 μL細(xì)胞懸液均勻接種于96孔培養(yǎng)板，5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞完全貼壁后，更換含10%胎牛血清的高糖DMEM 培養(yǎng)液同步化24 h后，低、中、高rhBMP-4 組分別加入終濃度為5、10、20 ng/L 的 rhBMP-4，空白對照組只加DMEM 培養(yǎng)液、陰性對照組加MG-63 細(xì)胞和DMEM 培養(yǎng)液，每組設(shè)5 個復(fù)孔，分別作用8、20、32、44 h 后取出培養(yǎng)板，吸去培養(yǎng)液，每孔加入0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.3)清洗1次，再在每孔中加入0.01 mol/L 磷酸鹽緩沖液(pH 7.3)100 μL 和 5 mg/mL 的 MTT 溶液 20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h 后，吸出培養(yǎng)液，每孔加入150 μL 二甲基亞砜，搖勻，用酶標(biāo)儀分別測定其540 nm波長處的光密度(D)。實驗重復(fù)3 次，取平均值計算細(xì)胞相對增殖率，細(xì)胞相對增殖率=[(D實驗組-D空白對照組)/(D陰性對照組-D空白對照組)]×100%[4]。

1.4 PNP比色法測定細(xì)胞堿性磷酸酶活性

經(jīng)10 ng/mL rhBMP-4 培養(yǎng)36 h 后出現(xiàn)肉眼可見的貼壁細(xì)胞時，將上清液移至EP管，以備后續(xù)實驗用，用PBS 緩沖液小心浸洗3 次，每孔加入100 μL 0.2%Triton X-100，于4 ℃下作用12 h，使細(xì)胞完全裂解，制成細(xì)胞裂解液。取30 μL 裂解液接種于另一96 孔培養(yǎng)板，空白對照孔用PBS 緩沖液取代rhBMP-4 細(xì)胞裂解液調(diào)零。按堿性磷酸酶測定試劑盒說明書加入同等比例緩沖液和基質(zhì)液，5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 min，加顯色劑，使用酶標(biāo)儀檢測D(405)值。實驗結(jié)果與對照比較，實驗重復(fù)3次，取平均值。

1.5 羥脯氨酸測定試劑盒檢測細(xì)胞羥脯氨酸含量

經(jīng)10 ng/mL rhBMP-4 培養(yǎng)36 h 后出現(xiàn)肉眼可見的貼壁細(xì)胞時，取50 μL 上清液移至EP 管，按羥脯氨酸測定試劑盒說明書逐步加入各試劑，使用酶標(biāo)儀檢測D(570)值。實驗結(jié)果與對照比較，實驗重復(fù)3次，計算平均值。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS11.5 統(tǒng)計軟件進行分析，符合正態(tài)分布的計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較用t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 rhBMP-4對MG-63細(xì)胞增殖影響

與對照組比較，5、10、20 ng/mL 的rhBMP-4均能誘導(dǎo)MG-63 細(xì)胞的增殖(P<0.05)，且呈濃度依賴性(圖1A)；10 ng/mL rhBMP-4 組與 20 ng/mL rhBMP-4 組間對MG-63 細(xì)胞增殖影響的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。在后續(xù)實驗中以10 ng/mL rhBMP-4 進行研究。進一步研究發(fā)現(xiàn)10 ng/mL rhBMP-4作用24 h后即可促進MG-63細(xì)胞增殖(P<0.05)，隨著時間的延長，其促增殖作用更加顯著，呈明顯的時間依賴性(圖1B)。

2.2 rhBMP-4 對MG-63 細(xì)胞堿性磷酸酶活性的影響

如圖2 所示，與對照組比較，10 ng/mL rhBMP-4增強了MG-63細(xì)胞的堿性磷酸酶活性(P<0.05)。

2.3 rhBMP-4 對MG-63 細(xì)胞分泌Ⅰ型膠原蛋白的影響

如圖3 所示，與對照組比較，10 ng/mL rhBMP-4可刺激MG-63細(xì)胞分泌Ⅰ型膠原蛋白(P<0.05)。

圖1 rhBMP-4對MG-63細(xì)胞增殖影響

圖2 rhBMP-4對MG-63細(xì)胞堿性磷酸酶活性影響

圖3 rhBMP-4對MG-63細(xì)胞分泌Ⅰ型膠原蛋白的影響

3 討論

MTT 法是一種通過顏色反應(yīng)來檢測細(xì)胞生長增殖和存活的方法[5]。其原理是活細(xì)胞內(nèi)線粒體琥珀酸脫氫酶能將MTT 還原為難溶性的藍紫結(jié)晶物甲臜，而甲臜生成量與細(xì)胞的增殖程度呈正相關(guān)，用酶標(biāo)儀檢測D(540)，能間接反映活細(xì)胞的數(shù)量及活性。本研究用MTT 法檢測人成骨樣細(xì)胞的增殖能力，根據(jù)測定結(jié)果來看，10 ng/mL rhBMP-4能促進人成骨樣細(xì)胞MG-63的增殖。

堿性磷酸酶是成骨細(xì)胞的一種標(biāo)志性外酶，從成骨組織中釋放出來而進入骨樣組織后發(fā)生鈣化[6]，是早期成骨的標(biāo)志，它與牙周組織的改建密切相關(guān)。堿性磷酸酶活性越高，骨形成能力越強，骨基質(zhì)礦化越快，堿性磷酸酶的定量檢測可作為成骨細(xì)胞分化程度和功能狀態(tài)的評價指標(biāo)。本研究發(fā)現(xiàn)，10 ng/mL rhBMP-4 能增強人成骨樣細(xì)胞MG-63的活性。

成骨細(xì)胞可分泌基質(zhì)蛋白，其中Ⅰ型膠原蛋白是其成骨階段分泌的主要礦化相關(guān)蛋白，是反映成骨的重要特異性指標(biāo)[7]。羥脯氨酸是Ⅰ型膠原蛋白合成所必需的前體氨基酸，可作為衡量機體膠原含量的重要指標(biāo)。rhBMP-4 是否影響人成骨樣細(xì)胞MG-63分泌Ⅰ型膠原可通過檢測培養(yǎng)液中羥脯氨酸的含量來驗證。本研究培養(yǎng)液中加入10 ng/mL rhBMP-4 后，羥脯氨酸的含量明顯提高，表明rhBMP-4 能促進成骨細(xì)胞分泌Ⅰ型膠原蛋白，從而增進骨的形成與礦化。

綜上所述，本研究證實BMP-4 可誘導(dǎo)人成骨樣細(xì)胞MG-63的增殖與分化，為BMP-4誘導(dǎo)成骨細(xì)胞活性的臨床應(yīng)用提供依據(jù)。