袁詩涵，徐蓓蓓，曹婉秀，張旭，唐慶娟

(中國海洋大學食品科學與工程學院，山東 青島 266003)

南極磷蝦(Euphausiasuperba)是南極海域主要的漁業(yè)捕撈品種，其數量巨大，繁殖速度快，被視為當今世界上生物儲備量最大的生物之一[1]。目前，國內外對于南極磷蝦的研究和利用主要集中在蛋白質和脂質等營養(yǎng)成分分析領域[2]。南極磷蝦中蛋白質的含量約為12%～15%，生物效價優(yōu)于牛乳蛋白，富含全部種類的人體必需氨基酸，符合FAO/WHO推薦標準，是人類潛在的蛋白儲備庫[3]。另有研究表明，南極磷蝦蛋白安全無毒，且生物利用率高，是一種高品質動物蛋白資源[4]。因此，南極磷蝦蛋白的深加工及其產業(yè)化發(fā)展具有廣闊前景。由于中國南極磷蝦漁業(yè)處于起步階段，磷蝦的綜合利用研究相對滯后，如何促進南極磷蝦加工業(yè)由生產初級食品向高附加值產品轉變的問題亟需解決[5-6]。目前，蝦粉、蝦肉和蝦糜是南極磷蝦深加工的基本原料。南極磷蝦經脫殼凍干得到蝦肉；脫殼后瀝水、凍干得到蝦糜；加水經蒸汽處理后瀝水、干燥及粉碎后得到蝦粉[7-8]。脫脂蝦粉是南極磷蝦提取磷蝦油后的副產品，價格低廉且含有豐富的蛋白質[9-10]，脫氟蝦粉可以避免南極磷蝦中氟含量過高對機體造成的損傷[11-12]。然而，高附加值的南極磷蝦蛋白產品市場知名度較低，對經過不同加工處理的南極磷蝦產品生物功效的研究相對較少，尤其是對腸道黏膜免疫的影響尚未明確。

食物被機體攝入后，首先作用于腸道黏膜，從而對機體免疫產生影響。腸道黏膜免疫是機體第一道免疫防線的重要組成部分，包括腸道特異性免疫和非特異性的腸黏膜屏障[13-14]。正常的組織結構是腸道發(fā)揮免疫功能的重要保證，小腸絨毛長度與隱窩深度的比值可以反映小腸的消化吸收與免疫機能狀態(tài)[15]。閉合蛋白(occludin)、緊密連接蛋白(claudin-1)及閉合小帶蛋白(ZO-1)在控制物質穿過腸上皮細胞時發(fā)揮主要作用，能夠阻止大分子、毒素及細菌等物質通過，是腸黏膜機械屏障的重要組成部分[16]。促炎因子IL-6和抑炎因子IL-10參與炎癥反應，調節(jié)炎性細胞因子的水平，影響細胞免疫應答，穩(wěn)定腸道黏膜內環(huán)境[17]。當腸黏膜屏障受損時，淋巴細胞被激活，免疫應答隨之啟動，產生大量分泌型免疫球蛋白A(sIgA)。sIgA是黏膜表面分泌量最大的一類免疫球蛋白亞型，能夠保護腸黏膜屏障功能，降低腸道病原體入侵導致全身性免疫反應的風險[18-19]。

本研究通過大鼠模型，研究磷蝦肉、磷蝦糜、普通磷蝦粉、脫脂磷蝦粉和脫脂脫氟磷蝦粉5種不同加工處理所得的產品對腸黏膜免疫的影響，從而明確不同磷蝦產品增強腸道免疫的作用，評定磷蝦產品的生物活性及安全性，為南極磷蝦蛋白的開發(fā)利用提供理論依據，促進南極磷蝦的精深加工發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料、動物與試劑

主要包括：冷凍南極磷蝦，購于中國水產股份有限公司。5種磷蝦產品蛋白的制備及含量的檢測參照本課題組前期建立的方法[10]。南極磷蝦去殼凍干得到蝦肉，蛋白質含量為(72.34±0.38)%；去殼采肉后經漂洗、擠壓、瀝水及凍干得到蝦糜，蛋白質含量為(77.34±0.41)%；取蝦糜加水經蒸汽處理、擠壓、瀝水、熱風干燥并粉碎后得到普通蝦粉，蛋白質含量為(65.12±0.52)%；普通蝦粉經95%乙醇處理，過濾后取濾渣自然風干燥得到脫脂蝦粉，蛋白質含量為(73.28±0.79)%；脫脂蝦粉經0.3 mol/L HCl(1∶10，w/v)酸處理后取沉淀，重復3次后熱風干燥得到脫氟蝦粉，蛋白質含量為(78.17±0.68)%。

SPF級Sprague-Dawley大鼠雄性60只(4周齡，體質量80～100 g)，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司(動物許可證號：SCXK (京) 2016-0011)。

Trizol抽提試劑(美國Invitrogen公司)；5X All-In-One RT MasterMix、EvaGreen 2X qPCR Master Mix(加拿大ABM公司)；組織蛋白裂解液(RIPA+PMSF)、BCA 蛋白測定試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)；抗體：大鼠單克隆GAPDH-HRP、羊抗大鼠IgA-HRP及羊抗大鼠IgG-HRP抗體(美國Proteintech公司)；分泌型免疫球蛋白A(sIgA)、白細胞介素6(IL-6)及白細胞介素10(IL-10)ELISA Kit(蘇州卡爾文生物科技有限公司)。

1.2 儀器與設備

主要包括：Ultra Trurrax T18 Basic型手持高速勻漿機(德國IKA公司)；MR-23i 型高速冷凍離心機(法國Jouan公司)；BX41光學顯微鏡(日本Olympus公司)；Nanodrop 2000/2000C分光光度計(美國Thermo Scientific公司)；Real-time PCR 儀(iQ5型)(美國Bio-Rad公司)；電泳儀(北京六一儀器廠)；GIS-2008 型凝膠掃描成像系統(tǒng)(上海天能有限公司)；Model680酶標儀(美國Bio-Rad公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物分組

SPF級雄性SD大鼠在適應性飼養(yǎng)3 d后，根據體重將其隨機分為6組：對照組、蝦肉組、蝦糜組、普通蝦粉組、脫脂蝦粉組和脫脂脫氟蝦粉組，每組10只。飲食組成配比采用AIN-93標準，飼料配方參考Wong等[20]報道的方法，其中，對照組蛋白質來源為酪蛋白，其余5組分別為不同磷蝦蛋白產品。根據各產品中蛋白質的含量配制飼料，使蛋白質含量為10%，其余各種成分比例不變[20]，飼料配方列于表1。所有大鼠采取自由進食飲水的方式，限制食物供給量為20 g/天。實驗周期為4周，飼養(yǎng)條件：溫度(22±2) ℃，濕度為(65±15)%。

1.3.2 腸道病理學組織切片與蘇木素-伊紅(HE)染色

大鼠處死后，取小腸空腸段2 cm，固定于4%的多聚甲醛中，24 h后經脫水透明、浸臘包埋，使用切片機切成5 μm厚度的切片。經過脫蠟、HE染色，用中性樹膠封片[21]。在光學顯微鏡100倍放大倍數下觀察組織病理變化，每個標本挑選6根最長且結構完整的絨毛，使用Image-Pro Plus 6.0圖片處理軟件測量絨毛長度(Villus length)和隱窩深度(Crypt length)，并計算V/C比值。

1.3.3 RNA的提取及RT-qPCR

在室溫下使用TRIzol試劑，通過手持高速勻漿機提取來自小腸空腸段樣品的總RNA，并使用Nanodrop 2000系統(tǒng)對其定量并檢測純度。用5X All-In-One RT MasterMix試劑盒將提取得到的RNA逆轉錄為cDNA。將cDNA稀釋一定倍數后，使用EvaGreen 2X qPCR Master Mix試劑盒按照25 μL體系在X960實時PCR系統(tǒng)上運行，PCR擴增程序設定參考鄭榮[21]報道的方法。引物由上海生工生物工程有限公司合成，序列列于表2。

表1 動物實驗飼料成分表Tab.1 Ingredients of laboratory animal diets g

表2 引物合成序列表Tab.2 Primer sequences listing

1.3.4 Western Blot

取小腸空腸段4 cm于RIPA裂解緩沖液和PMSF(0.01 mmol/L)中勻漿，然后將裂解物離心收集上清液(12 000 g，5 min)。使用BCA試劑盒測定蛋白質濃度，并將其調為一致，然后與SDS上樣緩沖液混合并于100 ℃金屬浴變性15 min，最后在10%SDS-PAGE凝膠上分離，設置電壓為100 V，電泳至溴酚藍剛跑出即終止電泳。通過半干法將蛋白質轉移至0.22 μm PVDF膜，采用恒定電流轉膜，依據目的蛋白分子量確定轉膜時間，再用5%BSA溶液封閉。將膜與針對GAPDH的一抗孵育，4 ℃下過夜，再與二抗羊抗大鼠IgG-HRP在室溫下連續(xù)孵育2 h，ECL顯色，通過凝膠成像系統(tǒng)掃描凝膠圖像；對于IgA則將膜與羊抗鼠IgA-HRP在室溫下孵育2 h后即可顯色。

1.3.5 ELISA

取小腸回腸段4 cm于生理鹽水中在冰浴條件下勻漿，然后將勻漿液以3 000 r/min離心10 min，收集上清液。使用sIgA、IL-6和IL-10 ELISA Kit 測定小腸組織中sIgA、白細胞介素6(IL-6)及白細胞介素10(IL-10)的濃度。

1.4 數據處理

實驗結果用平均值±標準偏差(x±SD)表示，由GraphPad Prism 8構建圖形。數據分析采用SPSS 24.0軟件進行單因素方差分析，與對照組相比，P<0.05為存在顯著差異，P<0.01為存在極顯著差異。

2 結果與分析

2.1 南極磷蝦產品對腸黏膜屏障結構的影響

2.1.1 腸道病理學組織切片觀察

小腸組織形態(tài)如圖1所示，結果表明，以酪蛋白為飼料蛋白質來源的對照組(LP)小腸結構完整，絨毛排列緊密且呈細長狀，各實驗組結果顯示其組織形態(tài)無顯著損傷，絨毛排列整齊有序。統(tǒng)計后發(fā)現，5種南極磷蝦產品均可以在一定程度上使絨毛長度增加，提高V/C比值。其中，蝦肉組(KMP)與脫脂脫氟組(DKP)相比對照組(LP)均出現顯著升高(P<0.05)，平均分別升高33.66%、29.19%。結果表明，南極磷蝦產品有益于維持小腸正常的組織結構及生理功能，增強腸道機械屏障功能，其中，蝦肉組效果最為顯著，脫脂脫氟組次之。

2.1.2 南極磷蝦產品對腸道緊密連接水平的影響

不同南極磷蝦產品對腸道通透性的影響如圖3，與對照組相比可發(fā)現，5種磷蝦產品均沒有破壞腸道通透性，且脫脂脫氟蛋白組(DKP)閉合蛋白(occludin)與閉合小帶蛋白(ZO-1)兩種蛋白mRNA表達量顯著增加(P<0.05)，平均分別升高61.51%、38.98%，緊密連接蛋白(claudin-1)升高44.06%；蝦肉組(KMP)claudin-1的mRNA表達量顯著增加(P<0.05)，平均升高61.07%，ZO-1和occludin分別升高30.64%和42.57%。腸上皮細胞間的緊密連接可以維持腸道的正常結構，阻擋病原微生物入侵機體[22]。結果表明，脫脂脫氟組與蝦肉組的南極磷蝦蛋白的攝入能夠增強腸上皮細胞間的緊密連接水平，提高腸黏膜機械屏障水平。

2.2 南極磷蝦產品對腸道炎癥因子水平的影響

如表3和圖4所示，與對照組相比，脫脂脫氟組(DKP)與蝦肉組(KMP)白介素6(IL-6)水平均顯著下降(P<0.05)，分別平均降低15.88%、14.89%；而蝦肉組(KMP)白介素10(IL-10)水平均顯著升高(P<0.05)，平均增加58.5%，脫脂脫氟組(DKP)增加30.0%。統(tǒng)計二者比值發(fā)現，5種磷蝦產品均可以顯著上調IL-10/IL-6比值。當機體免疫能力受損時，促炎因子IL-6水平有所上升，而IL-10是細胞免疫反應的負調節(jié)因子，水平會相應下降，研究中常用二者比值指示機體細胞免疫反應的水平。因此，南極磷蝦產品可以調節(jié)細胞免疫反應，維持腸道黏膜內環(huán)境穩(wěn)態(tài)，避免腸道炎癥的發(fā)生。其中，蝦肉組效果最為顯著，與對照組相比，IL-10/IL-6比值平均增加86.25%(P<0.01)，脫脂脫氟組次之，平均提高54.54%(P<0.05)。

表3 腸黏膜IL-10、IL-6含量Tab.3 IL-10 and IL-6 contents in intestinal mucosa n=10，ng·g-1

2.3 南極磷蝦產品對腸黏膜sIgA分泌的影響

SIgA是腸道黏膜屏障的效應因子之一，當其水平出現異常下降時，無法阻止細菌、病毒等病原體黏附于腸道，使腸道黏膜屏障受損[23]。圖5結果表明，與對照組相比，5種受試物處理后，腸道sIgA含量均有所提升，其中，脫脂脫氟組(DKP)與蝦肉組(KMP)水平顯著增加(P<0.01)，平均分別提高30.36%、21.97%。結果表明，脫脂脫氟組與蝦肉組的南極磷蝦產品可有效增加腸黏膜sIgA分泌，對增強腸黏膜免疫屏障有促進作用，且前者增強作用更顯著。

2.4 南極磷蝦產品對腸道IgA水平的影響

IgA具有多種抗體活性，能夠抗菌、抗毒素和抗病毒，是小腸中極為重要的免疫蛋白[23]。如圖6所示，與正常組相比，各組腸道IgA蛋白相對表達量出現差異，其中，蝦肉組(KMP)蛋白表達量顯著增加(P<0.05)，平均提高30.24%；脫脂脫氟組平均提高7.64%。結果表明，蝦肉組可有效提高腸道IgA蛋白表達水平，顯著增強小腸組織的免疫功能。

3 討論

目前，針對不同南極磷蝦產品的蛋白質營養(yǎng)價值評價及生理活性、食用安全性的研究逐漸增多[24-25]。有研究表明，在大鼠模型中，南極磷蝦蛋白支持蛋白質的合成，且對血脂沒有負面影響[26]。南極磷蝦作為優(yōu)質蛋白質的新來源，應該根據加工產品的用途，選擇相應的制備方法，從而體現其生物活性，以推動南極磷蝦蛋白的精深加工發(fā)展[7]。

加工方式能夠影響食品原料中功能成分的活性[27]。探究不同南極磷蝦蛋白產品形式的營養(yǎng)特性，對提升南極磷蝦產品價值具有重要意義[3]。已有研究指出，南極磷蝦產品蛋白及其衍生物具有抗菌、降血壓及抗氧化等作用[24,28]。迄今為止，針對南極磷蝦產品對腸道黏膜免疫的影響尚未見報道。本研究從南極磷蝦產品影響腸道免疫能力的角度考慮，通過建立大鼠模型，探討了不同加工方式處理后磷蝦產品對腸黏膜免疫的影響。

研究表明，5種南極磷蝦產品可以在一定程度上增強大鼠腸黏膜免疫能力，這與Gao等[29]和朱旺明等[30]報道的磷蝦粉與磷蝦蛋白可以提高機體抗氧化和免疫性能的結論相一致。此外，5種磷蝦產品提高大鼠腸黏膜sIgA分泌量的能力有所不同。蝦肉組和脫脂脫氟組增強腸黏膜免疫的作用較為顯著，提示二者對于大鼠腸道獲得性免疫具有顯著的改善作用[18]。進一步研究顯示，蝦肉和脫脂脫氟蝦粉提高了小腸組織IgA的蛋白表達量，推測其可通過上調漿細胞IgA表達量，從而促進腸黏膜sIgA的分泌[19]。蝦肉作為3種粗加工產品中方式最簡單的一種，極大程度地保存了磷蝦原有的蛋白結構與功能[10]，因此其增強腸黏膜免疫的效果尤為顯著。而氟含量超標是限制南極磷蝦蛋白資源開發(fā)利用的瓶頸問題。據測算，磷蝦蛋白脫氟處理后，每年可獲取400～500萬t的優(yōu)質動物蛋白，從而大大緩解了全球的糧食壓力[31]。本研究中脫脂脫氟磷蝦粉促進sIgA分泌量的能力優(yōu)于蝦肉，而提高IgA表達量的水平低于蝦肉。不同加工方式處理后的南極磷蝦產品對sIgA和IgA的影響呈現出差異，提示影響sIgA分泌的因素不僅限于IgA的表達量[32]。5種產品對腸黏膜免疫的增強作用存在差異，蝦肉和脫脂脫氟磷蝦粉相較于蝦糜、普通磷蝦粉和脫脂磷蝦粉產品的增強效果更為顯著，這是否與產品中非蛋白組分的含量與種類有關仍需進一步研究。

4 結論

5種磷蝦產品均可以提高V/C值，增強腸道機械屏障，調節(jié)炎性細胞因子水平，改善腸道免疫屏障功能，維持腸道的健康狀態(tài)。此外，蝦肉和脫脂脫氟蝦粉可以上調小腸IgA的表達，提高腸黏膜sIgA的分泌量，對腸道獲得性免疫具有改善作用。以上結果表明，南極磷蝦粉在脫脂脫氟處理后，仍然具有較好的增強腸黏膜免疫生物活性能力。本研究成果為南極磷蝦產品的活性研究提供了理論基礎，將促進南極磷蝦作為新型蛋白資源在食品工業(yè)的應用，推動南極磷蝦資源的綜合開發(fā)。