戴芹 繆怡 王偉銘

200031上海，上海市徐匯區(qū)中心醫(yī)院腎內(nèi)科(戴芹)，檢驗科(繆怡)；200020 上海，上海交通大學醫(yī)學院附屬瑞金醫(yī)院腎內(nèi)科(王偉銘)

IgA腎病(IgAN)目前被認為屬于自身免疫性疾病，是全世界范圍內(nèi)最常見的腎小球疾病[1-2]，是引起腎衰竭的重要病因[3-4]。由于機體免疫功能異常導致循環(huán)中致病性低糖基化IgA1(Gd-IgA1)產(chǎn)生過多，繼而發(fā)生自身積聚或與循環(huán)中的IgG結(jié)合形成致病性免疫復合物。腎小球沉積的IgA幾乎都是IgA1亞類[5-6]，含有Gd-IgA1是IgAN的重要病理特征[7]。Wada等[8]通過111例患者進行回顧性研究發(fā)現(xiàn)，IgAN患者血漿及腎組織系膜中Gd-IgA1明顯增加，而且血漿Gd-IgA1濃度與患者腎組織中腎小球硬化和小管間質(zhì)損害程度成正相關。有研究表明Gd-IgA1的產(chǎn)生與兩類糖基化酶密切相關：core 1 β1，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶(C1GalT1，由C1GALT1基因編碼)[9]及α-2，6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶2(ST6GalNAc-II，ST6GALNAC2基因編碼)[10-11]，然而導致這兩類糖基化酶表達異常的深層機制尚不清楚。

近年來，表觀遺傳學在疾病發(fā)病機制中的作用得到日益關注。賴氨酸殘基的翻譯后乙酰化已成為所有真核生物中的關鍵調(diào)節(jié)機制[12]。組蛋白乙酰化和去乙?；揎棇蜣D(zhuǎn)錄的激活與抑制及對遺傳過程的不同時期的轉(zhuǎn)換都起著重要的調(diào)控作用[13-14]。本研究擬通過檢測和分析不同CKD分期、不同蛋白尿水平的IgAN患者血漿Gd-IgA1濃度，明確Gd-IgA1與IgAN疾病嚴重程度的相關性。同時首次從表觀遺傳學角度探討導致IgA1低糖基化的可能機制，旨在豐富IgAN的發(fā)病機制，為IgAN的治療和干預提供新的思路。

資料與方法

一、研究對象及儀器、試劑

1.研究對象 本研究選取2013年1月至2015年3月于上海交通大學醫(yī)學院附屬瑞金醫(yī)院腎內(nèi)科住院的首次腎活檢確診為原發(fā)性IgAN患者59例和對照組30例，對照者30例均來自瑞金醫(yī)院體檢站，所有參與者均簽署知情同意書。IgAN組：共59例，其中男30例，女29例，年齡分布16～65歲，平均年齡37.2歲，中位年齡為37歲。對照組：共30例，男16例，女14例。年齡分布24～54歲，平均年齡34歲，中位年齡36歲。

原發(fā)性IgAN組入選標準如下：(1)首次確診的IgAN患者，未接受過激素、免疫抑制劑等治療；(2)年齡為15～65歲；(3)CKD1～4期患者(依據(jù)2012年KDIGO指南對CKD的分期標準)。排除標準如下：(1)排除因腫瘤、高血壓、代謝性疾病(如糖尿病)、乙肝、自身免疫性疾病(如狼瘡、甲亢等)、遺傳性腎病、系統(tǒng)性血管炎等繼發(fā)性因素引起者；(2)肝功能指標異常者；(3)妊娠或哺乳期婦女；(4)有感染或應激情況存在者；(5)嚴重心血管疾病如心功能不全，惡性高血壓，心律失常等患者；(6)CKD5期及已經(jīng)腎替代治療的患者。

2.主要儀器和試劑 梯度PCR儀(美國 MJ-research)；熒光實時定量PCR儀(美國 Bio-Rad)； qRT-PCR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(invitrogen)；人外周血淋巴細胞分離液(上海普飛)；人低糖基化免疫球蛋白A1酶聯(lián)免疫檢測試劑盒(上海晶天)；染色質(zhì)免疫共沉淀試劑盒(millipore)；anti-HDAC1 antibody CHIP Grade(美國Abcam)；Anti-Histone H3Ac antibody-ChIP Grade(美國Abcam)；PCR 引物均由中國鉑尚生物有限公司合成，其他試劑均為分析純產(chǎn)品。

二、方法

1.標本收集 本研究共收集了59例IgAN患者及30例對照者外周血各15 mL至肝素抗凝管中?？鼓? 000 r/min,離心半徑1 500 g,室溫離心10 min后收集上清，0.5 mL置EP管分裝備用。上述離心后的抗凝血用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)1∶1稀釋后充分混勻后用Ficoll法分離外周血單個核細胞。

2.IgA1及Gd-IgA1檢測 采用ELISA法檢測IgAN組及對照組血漿IgA1及Gd-IgA1水平。

3.染色質(zhì)免疫共沉淀(CHIP)檢測 按照染色質(zhì)免疫共沉淀試劑盒的protocol進行實驗。第一天：將外周單個核細胞用甲醛交聯(lián)后超聲破碎，檢驗超聲效果，確保DNA的大小為200～1000 bp；第二天：清除超聲破碎后的DNA中雜質(zhì)后用乙?；贵w與DNA片段進行孵育；第三天：免疫復合物的沉淀及清洗；第四天：DNA樣品的回收和純化；第五天：進行CHIP-qPCR檢測目的基因組蛋白的乙?；?。CHIP-qPCR的引物序列見表1。

表1 C1GALT1和ST6GALNAC2啟動子區(qū)域引物序列

4.real-time PCR檢測 熒光染料法檢測C1GALT1和ST6GALNAC2的 mRNA轉(zhuǎn)錄水平。以10 μL體系進行real time-PCR擴增，以GAPDH為內(nèi)參。每次實驗設3復孔，獨立實驗重復3次。C1GalT1和ST6GALNAC2引物序列見表2。

表2 C1GalT1和ST6GALNAC2 real-time PCR 引物序列

三、統(tǒng)計學方法

結(jié) 果

一、基本資料

研究中納入的IgAN患者中CKD1～2期的占了總數(shù)70%，CKD3期占了總數(shù)20%，CKD4期占了總數(shù)10%，顯示該研究人群的病情相對較輕。24 h蛋白尿定量>150mg即診斷為蛋白尿。本研究中蛋白尿分級標準為：24 h蛋白尿定量<1g為輕度蛋白尿，1～3.5 g為中度蛋白尿，>3.5 g為大量蛋白尿，19%的患者僅有少量蛋白尿，68%的患者呈中等蛋白尿，而大量蛋白尿的患者僅占了13%。兩組研究對象的基本特征如表3所示。

二、IgAN組與對照組血漿IgA1及Gd-IgA1濃度比較

與對照組比較，IgAN組血漿IgA1和Gd-IgA1濃度均顯著升高(均P<0.01)，兩者差異具有統(tǒng)計學意義。(表4)

三、IgAN患者血漿Gd-IgA1濃度與24 h尿蛋白定量及eGFR值的相關性

IgAN患者血漿Gd-IgA1濃度與24 h尿蛋白定量呈正相關(r=0.479，P=0.005)；IgAN患者血漿Gd-IgA1濃度與eGFR水平無顯著相關性(r=0.087，P=0.56)。(圖1)

四、IgAN組與對照組C1GALT1及ST6GALNAC2的mRNA表達量比較

Real-time PCR結(jié)果顯示，與對照組比較，IgAN組C1GALT1 mRNA的表達量顯著下降，為對照組的(0.28±0.06)倍(P<0.01)； ST6GALNAC2的mRNA表達量顯著升高，為對照組的(2.88±0.60)倍(P<0.01)。(表5)

表3 IgAN組與對照組的基本特征比較

表4 IgAN組與對照組血漿IgA及Gd-IgA1的濃度比較

表5 兩組C1GALT1及ST6GALNAC2的mRNA表達量的比較

五、 IgAN組與對照組糖基化酶基因C1GALT1和ST6GALNAC2啟動子區(qū)組蛋白H3和H4乙酰化水平比較

應用H3Ac和H4Ac抗體分別進行CHIP實驗，對免疫沉淀的DNA樣本及各自的Input使用引物擴增C1GALT1和ST6GALNAC2啟動子區(qū)域。結(jié)果顯示，與對照組相比，IgAN組C1GALT1基因啟動子區(qū)域組蛋白H3、H4乙?；潭冉档?，分別為[(0.43±0.20)比(1.00±0.27)，P<0.05]和[(0.62±0.11)比(1.07±0.09)，P<0.01]； ST6GALNAC2基因啟動子區(qū)域組蛋白H3、H4乙?；潭染@著升高，分別為[(3.42±1.32)比(1.00±0.37)，P<0.05]和[(2.07±0.29)比(1.10±0.07)，P<0.01]。(表6)

討 論

IgAN是一種常見的腎小球性疾病，以IgA或者IgA為主的免疫復合物腎小球內(nèi)沉積為特征，臨床表現(xiàn)不一，預后各不相同[15]，是導致終末期腎病的重要因素，40%IgAN患者在20年內(nèi)將緩慢進展至終末期腎病[16-17]。研究發(fā)現(xiàn)IgAN起病時尿蛋白、腎功能和腎臟病理是提示預后最重要的指標[18]。最新的研究發(fā)現(xiàn)，在IgAN患者冷凍腎組織中均含有Gd-IgA1特異性IgG自身抗體，這一發(fā)現(xiàn)再次揭示了Gd-IgA1在IgAN發(fā)病機制中的重要性[19]。

本研究檢測了59例IgAN患者及30例對照者外周血漿IgA1及Gd-IgA1濃度，結(jié)果顯示IgAN組IgA1及Gd-IgA1濃度均顯著高于對照組。我們將59例IgAN患者Gd-IgA1值分別與其24 h尿蛋白量進行相關性分析發(fā)現(xiàn)，IgAN患者Gd-IgA1值與24h尿蛋白量呈顯著正相關。Zhao等[20]通過對275例IgAN患者進行了最長達96個月隨訪的前瞻性研究發(fā)現(xiàn)：低糖基化IgA1的血清濃度越高，IgAN患者的預后越差；低糖基化IgA1的血清水平越高，其進展至腎功能衰竭的風險就越大。

IgAN患者不僅血漿Gd-IgA1濃度升高，更有研究發(fā)現(xiàn)其尿液中Gd-IgA1排泄顯著增加，且尿液中Gd-IgA1濃度與尿蛋白的量呈正相關[21]，該項結(jié)果跟我們研究結(jié)果一致。但是本研究未發(fā)現(xiàn)患者Gd-IgA1值與其CKD分期之間有顯著相關性，有可能與我們?nèi)虢M的患者大多為CKD1期和2期的患者有關。

表6 兩組糖基化酶基因C1GALT1和ST6GALNAC2啟動子區(qū)組蛋白H3和H4乙酰化水平比較

IgA1糖基化修飾與兩類糖基化酶密切相關：一為core 1 β1，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶(C1GalT1，由C1GALT1基因編碼)[9]，其主要作用是增加N-乙酰半乳糖胺的半乳糖基化；另一為α-2，6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶2(ST6GalNAc-II，ST6GALNAC 2基因編碼)[10]，其主要作用是將唾液酸基加到N-乙酰半乳糖胺上[22]，減少其半乳糖基化程度。在IgAN中主要表現(xiàn)為C1GalT1的表達減少，活性降低；同時ST6GalNAc-II高表達，活性增加[3]。本研究應用real-time PCR的方法分別檢測顯示，IgAN組外周血單個核細胞中C1GALT1 mRNA的表達較對照組出現(xiàn)了顯著的下調(diào)，而ST6GALNAC2 mRNA的表達量則是出現(xiàn)了顯著的上調(diào)，與Suzuki等[3]的研究結(jié)果相一致。但是，IgAN中C1GALT1 mRNA出現(xiàn)顯著下調(diào)，ST6GALNAC2的mRNA顯著上調(diào)的內(nèi)在機制仍不清楚。

疾病表型的變異可以歸因于遺傳因素和環(huán)境因素[23]。研究表明，基因組的變異會影響慢性腎臟病的發(fā)生和發(fā)展[24]。然而，由于環(huán)境因素而導致的表觀遺傳機制對于維持基因組的正常功能也是很關鍵的[25]。近年來研究表明，表觀遺傳學機制參與了各種腎臟疾病的發(fā)病機制[26]。表觀遺傳學機制中最受關注的是細胞核中的乙?；?。在細胞核中，乙酰化修飾主要調(diào)節(jié)組蛋白生物學和轉(zhuǎn)錄[12，27-29]。質(zhì)譜技術的進步揭示了幾乎所有細胞內(nèi)均有乙酰化的相關靶點[30-31]。細胞內(nèi)乙?；怯梢阴；腿ヒ阴；剿璧拿?、代謝物和輔助因子的定位所驅(qū)動。

本研究應用CHIP-qPCR的方法檢測了IgA糖基化過程中密切相關的兩個基因啟動子區(qū)的H3和H4乙?；?。結(jié)果顯示，IgAN組C1GALT1基因啟動子區(qū)H3和H4乙?；^正常對照組均顯著下降，ST6GALNAC2基因啟動子區(qū)的H3和H4乙酰化水平較正常對照組均顯著升高。C1GALT1基因啟動子區(qū)的H3和H4乙?；较陆岛笫沟萌旧|(zhì)呈相對“關閉”狀態(tài)，從而抑制了C1GALT1基因的表達。ST6GALNAC2基因啟動子區(qū)的H3和H4乙?；捷^正常人升高，使得染色質(zhì)呈相對“開放”狀態(tài)，從而促進了ST6GALNAC2基因的表達，這兩個基因的異常表達參與了Gd-IgA1的形成過程。

總之，本研究通過對IgAN患者及對照者外周血IgA及Gd-IgA1濃度的檢測以及IgAN患者Gd-IgA1與24 h尿蛋白及eGFR水平的相關性分析，再次驗證了Gd-IgA1在IgAN發(fā)病和發(fā)展過程中的重要作用。本研究首次從組蛋白乙酰化角度探究了糖基化酶基因表達發(fā)生改變的內(nèi)在機制，從表觀遺傳學角度豐富了IgAN的發(fā)病機制，為IgAN的治療和干預提供新的思路。由于患者腎穿刺組織來源受限，以及技術上針對性地檢測單個腎小球系膜區(qū)Gd-IgA1的沉積量存在難度，本研究未能探討IgAN患者血漿Gd-IgA1濃度是否與患者腎臟病理改變或者組織中IgA1的表達有相關性，有待今后進一步完善。