王明洋,牛紅妹,張 麗,李雅莉,李 林,張 蘭

(首都醫(yī)科大學宣武醫(yī)院藥學部；北京市神經(jīng)藥物工程技術研究中心；北京腦重大疾病研究院；神經(jīng)變性病教育部重點實驗室，北京 100053)

腦卒中是導致中國居民死亡和殘疾的第一致病因素，同時給社會和病患家庭帶來極重的經(jīng)濟壓力[1]。在腦缺血導致的多種病理損傷中，線粒體能量代謝障礙被當作是引發(fā)系列損傷的源頭[2]。且日益增多的研究證據(jù)表明，腦缺血后線粒體功能障礙可直接影響神經(jīng)元的存活或死亡狀態(tài)[3]，調控并維持正常線粒體網(wǎng)絡穩(wěn)態(tài)有助于神經(jīng)系統(tǒng)功能的執(zhí)行，靶向線粒體的新藥研發(fā)有可能為腦缺血治療帶來新的突破。

細胞內線粒體網(wǎng)絡穩(wěn)態(tài)依賴于嚴密精準的線粒體質量控制系統(tǒng)(mitochondria quality control，MQC)調控，主要包括線粒體自噬及分裂、融合等線粒體動力學過程[4]。線粒體自噬是受損或者老化的線粒體被選擇性降解的途徑，經(jīng)由激活的AMPK-ULK-Beclin通路啟動自噬作用，細胞將受損線粒體部分隔離成為自噬小體，隨后通過溶酶體途徑降解，防止受損線粒體在細胞內堆積[5]。而線粒體經(jīng)過不斷的分裂融合可保證各個線粒體之間內容物的互換，促進健康線粒體的生成并分離受損部分。且有研究表明，激活的線粒體分裂可進一步刺激線粒體自噬過程來加速清除受損的線粒體[6]。受損線粒體的及時清除可有效阻斷其引起的細胞死亡。因此，通過調控MQC過程，減輕線粒體損傷，對于促進腦缺血后的神經(jīng)功能恢復有著重要意義。

傳統(tǒng)中藥山茱萸中含有大量的具有多種生物活性的環(huán)烯醚萜類化合物，莫諾苷是其中重要成分之一。研究表明，莫諾苷具有抗炎、抗凋亡、促血管生成等活性作用[7-8]。同時，本研究室前期研究發(fā)現(xiàn)，莫諾苷具有神經(jīng)保護作用[9]，但具體作用機制尚未完全闡明。本研究在體外培養(yǎng)的大鼠原代皮層神經(jīng)元上建立氧糖剝奪(oxygen-glucose deprivation，OGD)模型，模擬腦缺血損傷后神經(jīng)元的病理改變，研究莫諾苷對OGD后神經(jīng)元損傷的影響，并進一步從調控維持線粒體穩(wěn)態(tài)的線粒體質量控制體系的角度探討其發(fā)揮神經(jīng)保護作用的機制。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑莫諾苷(morroniside)(B20872)購于上海源葉生物科技有限公司，純度>97%。多聚賴氨酸(P6407)、連二亞硫酸鈉(Na2S2O4)(71699)等購于Sigma公司；Neurobasal(含/不含葡萄糖)(21103049，A2477501)、B27添加劑(17504044)等細胞用試劑購于Gibco公司；CCK-8檢測試劑盒購于北仁化學科技(北京)有限公司(CK04)；線粒體膜電位檢測試劑盒(C2006)、Fluo-4 AM(鈣離子熒光探針)(S1060)、蛋白酶磷酸酶抑制劑(P1045)、苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF)(ST506)、RIPA(P0013B)、BCA蛋白濃度測定kit(P0010)等購于碧云天生物技術有限公司；抗體AMPKα(#5832)、Phospho-AMPKα(Thr172)(#2535)、ULK1(#8054)、Phospho-ULK1(Ser555)(#5869)、Beclin1(#3495)、p62(#39749)、Nix(#12396)、OPA(#80471)、MFF(#84580)、β-actin(#3700)等購于CST公司。

1.2 儀器倒置熒光顯微鏡購于日本Olympus公司; CO2培養(yǎng)箱、臺式高速離心機購自美國Thermo公司;全波長酶標儀購于法國巴德斯公司；恒溫振蕩培養(yǎng)搖床購于武漢科學儀器廠；電子天平購于北京賽多利斯天平有限公司；凝膠電泳槽、電泳儀等購于美國Bio-Rad公司；化學發(fā)光成像儀購于上海天能公司。

1.3 原代神經(jīng)元培養(yǎng)取24 h內新生SD乳鼠(購于斯貝福生物技術有限公司，許可證號：SCXK(京)2019-0010)，用75%酒精消毒后斷頭，取出大腦，在預冷的D-Hanks液中漂洗后，去除中腦和海馬，剩余皮層部分，小心剔除腦膜后，將腦組織剪成約1 mm3的組織塊，用1～2 mL組織消化裂解液在37 ℃作用15 min后，加入DMEM高糖培養(yǎng)基終止消化，并吹打成單個細胞懸液，然后用70 μm網(wǎng)篩過濾收集懸液，離心5 min(1 000 r·min-1)，棄上清，用DMEM高糖培養(yǎng)基吹打重懸細胞，并計算母液細胞密度。調整合適細胞密度種板。接種后4 h將DMEM高糖培養(yǎng)基全部換成Neurobasal培養(yǎng)基(添加有2% B27)，隨后每隔2～3 d半量更換培養(yǎng)基。體外培養(yǎng)8～10 d用于后續(xù)實驗。

1.4 大鼠原代皮層神經(jīng)元氧糖剝奪模型的制備所有細胞培養(yǎng)成熟后分為5組：正常對照組，對照+莫諾苷25 μmol·L-1組，OGD模型組，OGD+莫諾苷12.5 μmol·L-1組，OGD+莫諾苷25 μmol·L-1組。OGD模型制備時棄去各細胞原培養(yǎng)基，除正常對照及對照+莫諾苷組細胞更換新的Neurobasal外，其余各組替換為含5 mmol·L-1Na2S2O4(氧剝奪)的 Neurobasal無糖培養(yǎng)基(糖剝奪)，在37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱孵育1 h建立OGD模型，后換為Neurobasal培養(yǎng)基，同時各給藥組分別加入終濃度為25、50 μmol·L-1的莫諾苷，正常對照組給予相應同體積Neurobasal，對照+莫諾苷組細胞給予含50 μmol·L-1莫諾苷的同體積Neurobasal。于培養(yǎng)箱中正常培養(yǎng)12 h或24 h后進行后續(xù)檢測。

1.5 CCK-8法檢測細胞存活率采用CCK-8試劑檢測細胞存活率。上述細胞處理24 h后，將各組細胞原有培養(yǎng)基除去，按100 μL/孔加入含10%(體積分數(shù))CCK-8的新鮮neurobasal，37 ℃孵育2 h后測定450 nm處吸光度(OD值)。以不含細胞的空白培養(yǎng)基組吸光度為基準調零，各組取平均值后按下式計算細胞相對存活率：細胞相對存活率/ % =(實驗組OD值/對照組OD值)×100%。

1.6 線粒體膜電位檢測采用JC-1法檢測神經(jīng)元內線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential，MMP)的變化。上述細胞處理12 h后，除去原有培養(yǎng)基，PBS洗2遍，加入適量1×JC-1試劑，于37 ℃反應30 min，之后再用PBS洗2遍，在倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照。使用Image-Pro Plus軟件定量分析圖像中紅色及綠色熒光強度，各組MMP的變化以紅/綠熒光強度比值顯示。

1.7 鈣離子濃度檢測采用Fluo-4 AM法檢測神經(jīng)元內鈣離子濃度的變化。上述細胞處理12 h后，除去原有培養(yǎng)基，PBS洗2遍，加入適量1 μmol·L-1Fluo-4 AM工作液，于37 ℃反應30 min，之后再用PBS洗2遍，繼續(xù)于37 ℃培養(yǎng)箱孵育約20～30 min后，在倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照。使用Image-Pro Plus軟件定量分析圖像中綠色熒光強度。

1.8 Western blot法檢測蛋白表達上述細胞處理12 h后，用細胞裂解液(RIPA ∶蛋白磷酸酶抑制劑 ∶PMSF=100 ∶2 ∶1)裂解收集；BCA法定量后變性；取相同質量蛋白進行SDS-PAGE電泳分離，濕轉法轉膜，5% BSA封閉后，孵育上述適當濃度的一抗，4 ℃過夜；TBST 洗膜3次，加入相應的二抗室溫下孵育1 h；棄去二抗，TBST洗膜3次；加ECL化學發(fā)光試劑曝光，保存適宜條帶圖像，使用GelPro 3.1定量分析圖像中目的蛋白豐度。

2 結果

2.1 莫諾苷對大鼠原代皮層神經(jīng)元氧糖剝奪(OGD)模型細胞存活率的影響本研究采用CCK-8法檢測OGD損傷后各組神經(jīng)元存活率。結果顯示，OGD損傷明顯抑制細胞活性，模型組皮層神經(jīng)元細胞存活率與對照組相比明顯降低(P<0.01)；莫諾苷(3.125、6.25、12.5、25 μmol·L-1)孵育24 h能夠明顯增高OGD細胞的存活率(P<0.05，P<0.01；Fig 1)。由于莫諾苷在12.5、25 μmol·L-1濃度時藥效最佳，因此后續(xù)實驗采用這兩個濃度進行作用機制研究。

Fig 1 Effects of morroniside on cell viability in OGD model of rat primary cortical Cells were incubated with serial concentrations of morroniside for 24 h after OGD damage. Cell viability was measured by CCK-8 assay. The cell viability in the control group was set as 100%.##P<0.01 vs CON group;*P<0.05,**P<0.01 vs OGD group.OGD, oxygen-glucose deprivation; CON: control group.

2.2 莫諾苷對大鼠原代皮層神經(jīng)元OGD模型線粒體損傷的影響本研究采用JC-1熒光染色法檢測神經(jīng)元MMP。結果顯示，正常對照組中紅色熒光較強，綠色熒光較弱，紅/綠熒光比值為4.41±0.46，而OGD損傷使得模型組中紅色熒光強度明顯降低，綠色熒光強度明顯增強，紅/綠熒光比值明顯降低至1.68±0.32(P<0.01)，表明模型組細胞MMP明顯下降。12.5、25 μmol·L-1莫諾苷孵育12 h可分別使OGD細胞的紅/綠熒光比值明顯增高至3.49±0.31、3.96±0.52(P<0.01；Fig 2)，表明MMP明顯增高。

Fig 2 Effects of morroniside on mitochondrial membrane potential in OGD model of rat primary cortical 25 μmol·L-1;c:OGD;d:OGD+Mor 12.5 μmol·L-1;e:OGD+Mor 25 μmol·L-1.Cells were incubated with morroniside for 12 h after OGD damage.(A) Representative images of JC-1-labeled mitochondrial membrane potential staining. Scale bar=50 μm.(B) Quantitative analysis of mitochondrial membrane potential(the fluorescent intensity ratio of red/green).##P<0.01 vs CON group;**P<0.01 vs OGD group.OGD:oxygen-glucose deprivation;CON:control group; Mor: morroniside.

此外，采用Fluo-4 AM檢測神經(jīng)元細胞內鈣濃度變化。結果顯示，與對照組相比，OGD模型組熒光強度明顯增強(P<0.05)，表明細胞內鈣濃度明顯增高。莫諾苷(12.5、25 μmol·L-1)孵育12 h使OGD細胞的熒光強度明顯降低(P<0.05，P<0.01；Fig 3)，表明細胞內鈣濃度明顯下降。

Fig 3 Effects of morroniside on intracellular calcium ion concentration in OGD model of rat primary cortical 25 μmol·L-1;c:OGD;d:OGD+Mor 12.5 μmol·L-1;e:OGD+Mor 25 μmol·L-1.A:Representative images of Fluo 4-AM fluorescence for intracellular calcium ion. Scale bar=50 μm.B:Quantitative analysis of fluorescence intensity of intracellular calcium ion. The fluorescence intensity in the control group was set as 1.0.#P<0.05 vs CON group;*P<0.05,**P<0.01 vs OGD group. OGD: oxygen-glucose deprivation; CON: control; Mor: morroniside.

2.3 莫諾苷對大鼠原代皮層神經(jīng)元OGD模型線粒體質量控制體系的影響線粒體MQC主要包含線粒體自噬及分裂、融合等調控線粒體穩(wěn)態(tài)的過程。本研究采用Western blot方法檢測MQC相關蛋白的表達。結果顯示，與對照組相比，OGD模型組神經(jīng)元內線粒體自噬受體蛋白Nix及線粒體裂變因子MFF的表達明顯下降(P<0.05，P<0.01)，自噬底物標志蛋白p62明顯增加(P<0.01)，表明線粒體自噬及分裂過程被抑制，但線粒體融合蛋白OPA的表達無明顯變化。莫諾苷孵育12 h使OGD細胞的Nix和MFF表達明顯增高(P<0.01，P<0.05)，p62表達明顯減低(P<0.01，F(xiàn)ig 4)，表明莫諾苷能夠增強線粒體自噬和分裂。

Fig 4 Effects of morroniside on mitochondria quality control in OGD model of rat primary cortical A:Representative images of Western blot for Nix, p62, MFF, and OPA;B:Quantitative analysis of Nix and p62;C:Quantitative analysis of MFF and OPA. β-actin served as an internal loading control.#P<0.05,##P<0.01 vs CON group;*P<0.05,**P<0.01 vs OGD group. OGD: oxygen-glucose deprivation; CON: control; Mor: morroniside.

AMPK-ULK-Beclin通路是調控自噬啟動的重要通路。本研究的Western blot結果顯示，OGD模型組AMPKα在Thr172位點的磷酸化、ULK1在Ser555位點的磷酸化及Beclin 1的表達均明顯降低(P<0.05，P<0.01，P<0.05)，表明AMPK/ULK/Beclin 1通路被抑制。莫諾苷孵育能使OGD細胞中AMPKα和ULK1的磷酸化以及Beclin 1的表達水平明顯增高(P<0.01，P<0.05；Fig 5)，表明莫諾苷可激活AMPK-ULK-Beclin通路。

Fig 5 Effects of morroniside on AMPKα/ULK1/Beclin1 pathway in OGD model of rat primary cortical A:Representative images of Western blot for phosphorylated(p-) AMPKα(at Thr172 site),total AMPKα, p-ULK1(at Ser555 site), total ULK1, and Beclin1;B:Quantitative analysis of p-AMPKα(Thr172), AMPKα, andp-AMPKα(Thr172)/AMPKα;C:Quantitative analysis of p-ULK1(Ser555), ULK1, and p-ULK1(Ser555)/ULK1.(D) Quantitative analysis of Beclin1. β-actin served as an internal loading control.#P<0.05,##P<0.01 vs CON group;*P<0.05,**P<0.01 vs OGD group. OGD: oxygen-glucose deprivation; CON: control; Mor: morroniside; AMPK: adenosine monophosphate-activated protein kinase.

3 討論

腦缺血導致各種損傷的始動因素是細胞或組織缺乏氧及能量的供應。本研究首先在大鼠原代皮層神經(jīng)元上建立OGD損傷模型，模擬神經(jīng)元在缺血損傷后的病理改變。結果發(fā)現(xiàn)，OGD損傷后加入莫諾苷干預可明顯增加神經(jīng)元細胞存活率，表明莫諾苷可對抗缺氧缺糖損傷，保護神經(jīng)元。

腦缺血引起神經(jīng)元損傷的諸多機制學說復雜，各學說之間互為因果，互相關聯(lián)[10]，其中能量代謝障礙是各損傷機制的首發(fā)環(huán)節(jié)。腦缺血發(fā)生后，最先影響的是缺血組織的血氧供應下降，持續(xù)缺血缺氧狀態(tài)可嚴重損害腦氧合狀態(tài)及線粒體功能，致使大腦細胞能量耗竭，進一步引發(fā)系列復雜的級聯(lián)反應，最終導致細胞死亡及神經(jīng)功能障礙[2]。線粒體作為細胞的“能量中心”，首當其沖成為腦缺血后受損的首要靶區(qū)，其功能狀態(tài)同時是影響神經(jīng)元是否可以存活的重要元素[11]。神經(jīng)元內線粒體在缺血后迅速發(fā)生病理變化，其中線粒體膜電位(MMP)下降反映線粒體早期損傷，決定線粒體的功能狀態(tài)。MMP的改變可進一步誘發(fā)細胞離子代謝異常，引起細胞內鈣超載等。而過多的鈣離子沉積在線粒體上更加重了膜電位的崩解并引起細胞凋亡[11-12]。本研究結果顯示，OGD損傷引起神經(jīng)元MMP下降，細胞內鈣離子濃度異常增高；莫諾苷處理能有效恢復MMP及細胞內鈣濃度至正常水平，減輕OGD誘導的線粒體損傷。

MQC負責調控細胞內線粒體的形態(tài)及功能的完整性，及時處理各種病理生理狀態(tài)下包括腦缺血后引起的線粒體損傷，維持線粒體穩(wěn)態(tài)[4]。本研究基于MQC理論，進一步探討莫諾苷減輕線粒體損傷的作用機制，檢測了各過程的標記蛋白─線粒體自噬相關蛋白Nix、線粒體分裂因子MFF、線粒體融合蛋白OPA等的表達變化情況。Nix是定位于線粒體外膜的線粒體膜表面結合蛋白，主要負責調控缺氧或饑餓狀態(tài)下的線粒體自噬[13]。p62是自噬底物標志物。當細胞內自噬過程正常進行時，p62在自噬體與溶酶體快速結合后即被降解；而當自噬過程被抑制，自噬體的過多積累，使得p62不能被及時降解，其表達水平升高。因此，可以用p62的蛋白表達水平作為自噬能力變化的指征[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，OGD模型組神經(jīng)元線粒體自噬相關蛋白Nix表達減低，自噬底物蛋白p62表達增高，提示線粒體自噬受到抑制。莫諾苷能夠減輕OGD誘導的Nix表達下降，同時降低自噬底物蛋白p62的表達，提示莫諾苷可激活線粒體自噬，促進受損線粒體的清除。另一方面，OGD損傷對線粒體融合蛋白OPA無明顯影響，但減少了負責線粒體分裂過程的MFF表達，阻礙線粒體分裂；而莫諾苷可改善這一變化，增高MFF的表達。

已有研究表明，自噬的啟動需要ULK復合物的激活，AMPK-ULK-Beclin通路在其中發(fā)揮重要調節(jié)作用。AMPK活化后可促進ULK1在Ser555的磷酸化使ULK1激活，活化的ULK1進一步促進Beclin1誘導自噬啟動[15-16]。本研究結果顯示，OGD損傷導致神經(jīng)元內AMPK和ULK1的磷酸化水平以及Beclin1的表達降低，提示AMPK-ULK-Beclin通路活性降低，被OGD損傷所抑制。莫諾苷可明顯增高OGD細胞AMPKα和ULK1的磷酸化以及Beclin1的表達水平，提示莫諾苷可能通過上調AMPK-ULK-Beclin通路而激活神經(jīng)元線粒體自噬。

綜上所述，本研究在原代神經(jīng)元OGD模型中發(fā)現(xiàn)，莫諾苷能夠增高細胞存活率，具有神經(jīng)保護作用，其作用機制包括通過上調AMPK-ULK-Beclin通路，激活線粒體自噬，促進線粒體分裂，改善MQC，從而減輕線粒體損傷，保護神經(jīng)元抵抗缺氧缺糖損傷。