吳彥霖，張 媛，楊澤岸，胡文言，高 華

(1.中國食品藥品檢定研究院化學藥品檢定所藥理室, 北京 102629; 2.中國生化制藥工業(yè)協(xié)會，北京 100068)

骨肽是從新鮮或冷凍的豬、鹿或胎牛骨提取，加工制成的具有活性的多組分生化藥[1-2]，骨肽類藥物主要成分含有骨形成蛋白(bone morphogenetic protein，BMPs)等多種多肽類骨代謝活性因子，以及多種骨修復所需的無機元素、氨基酸及微量元素等[3]。骨肽類藥物臨床上主要用于骨質(zhì)疏松、骨質(zhì)增生、骨折及類風濕性關節(jié)炎等疾病治療，具有刺激成骨細胞增殖，促進新骨形成，調(diào)節(jié)鈣磷代謝，抗炎鎮(zhèn)痛等藥理作用[4-5]。骨肽原液是骨肽類藥物的原料，具有組分復雜，活性成分不明確的特點，現(xiàn)行的骨肽類藥物質(zhì)量標準收載于國家標準地升部十六冊，采用理化方法進行質(zhì)量控制，不能有效反映其多組分、多靶點的臨床療效[6]，因此建立關聯(lián)臨床功效的生物活性測定方法作為其質(zhì)量控制的方法更為合理。

大鼠骨肉瘤細胞UMR106在形態(tài)和性質(zhì)上保留有成骨細胞的特征，在研究中被用來代替成骨細胞，是一種國際公認的成骨樣細胞，也是研究骨代謝調(diào)控較好的模式細胞[7-9]。建立骨肽原液生物活性測定方法-大鼠骨肉瘤UMR106細胞增殖實驗，確定骨肽原液的限值，依據(jù)正交實驗確定方法的影響因素，并參照2015年版《中國藥典》9101 藥品質(zhì)量標準分析方法驗證指導原則和9105中藥生物活性測定指導原則進行方法學驗證[10]。

基于上述目的，建立骨肽原液生物活性測定方法研究包括：1)建立UMR106細胞增殖實驗方法；2)正交試驗優(yōu)化實驗條件，確定實驗方案；3)對建立的骨肽原液促UMR106細胞增殖實驗進行方法學驗證；4)對13個廠家共39批次的骨肽原液進行實驗，依據(jù)實驗結果制定相應的限值和判斷標準。

1 材料與方法

1.1 細胞株大鼠骨肉瘤細胞株UMR106，購于中國協(xié)和醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院細胞中心。

1.2 儀器CKX 41倒置顯微鏡(日本Olympus公司)；1389 A2生物安全柜(美國Thermo Fisher公司)；3141 CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo Fisher公司)；6R離心機(美國Beckman Coulter公司)：Z2細胞計數(shù)儀(美國Beckman Coulter公司)；SYNERGY HT酶標儀(美國Biotek公司)。

1.3 試劑及樣品胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、含谷氨酰胺的DMEM高糖培養(yǎng)基(Glutamine+, Glu+)、不含谷氨酰胺的DMEM高糖培養(yǎng)基(Glutamine-, Glu-)、胰酶均購自Gibco公司，批號分別為1989478、2044404、1998036、2053591；磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline, PBS)購自Hyclone公司，批號AD20616267；CCK-8購自東仁化學科技(上海)有限公司，批號NN707。 骨肽原液生產(chǎn)廠家及批號見Tab 1。

Tab 1 Manufacturer and batch number of bone peptide

1.4 溶液配制生長培養(yǎng)基：用DMEM高糖培養(yǎng)基(Glu+)配制含10%FBS的溶液；工作培養(yǎng)基：用DMEM高糖培養(yǎng)基(Glu-)分別配制含1%、5%、10%的FBS溶液，上述溶液4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

骨肽的樣品稀釋液：用工作培養(yǎng)基配將骨肽原液稀釋為0.06、0.125、0.25、0.5、1.0、2.0 g·L-1的溶液，臨用現(xiàn)配。

1.5 細胞傳代取對數(shù)生長期UMR106細胞融合度達到90%進行傳代，吸棄瓶中培養(yǎng)基，取10 mL PBS清洗1遍，加2 mL 0.25% Trypsin置CO2培養(yǎng)箱中消化30 s，加10 mL生長培養(yǎng)基終止消化，吹落培養(yǎng)瓶上貼壁細胞，將細胞懸液移至15 mL離心管中，充分混勻，1 000 r·min-1離心5 min，離心后盡量除去上清液，加入1 mL生長培養(yǎng)基，輕輕吹打混勻細胞沉淀。將細胞懸液按1 ∶5比例接種至T75培養(yǎng)瓶中，放入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育。

1.6 骨肽原液致UMR106細胞增殖方法建立將2.2消化后的細胞用PBS洗2次，每次1 000 r·min-1離心5 min，用工作培養(yǎng)基稀釋細胞至所需濃度，每孔100 μL接種于96孔細胞培養(yǎng)板。37 ℃，5% CO2培養(yǎng)24 h。棄去孔內(nèi)完全培養(yǎng)基，每孔加入骨肽的樣品稀釋液，設不加細胞的孔為完全空白組，陰性對照組(等量PBS代替藥物體積)。繼續(xù)培養(yǎng)72 h后使用CCK-8法進行測定細胞增殖率，實驗操作參照試劑盒說明書。

細胞增殖率/% =(供試品組A值-完全空白組A值)/(陰性對照組A值-完全空白組A值)×100%

1.6.1線性范圍和最低檢測限 取2.3細胞，調(diào)整細胞密度為2 000 個/孔，用1% FBS工作培養(yǎng)基將廠家B(batch No. 1)和C(batch No. 1)骨肽原液配制為2.1的濃度，每孔分別加入對應的組別藥物100 μL，作用48 h、72 h后計算細胞增殖率[7-9]，以細胞增殖率評價骨肽原液促UMR106細胞增殖活性，確定最低檢測限。

1.6.2正交實驗確定影響因素 選用廠家B(batch No. 1)的骨肽原液樣品進行正交實驗，正交設計方案：采用L9 (33)正交表，以3因素3水平正交實驗為考察條件進行實驗，具體見Tab 2和Tab 3。響應值為細胞增殖百分率。 正交實驗設計表如下表所示。

Tab 2 Factors and levels of orthogonal experiment

Tab 3 Arrangement of orthogonal experiment

1.7 方法學驗證[10]

1.7.1重復性 參考2.3.2正交實驗結果，選用廠家B(batch No. 1)的骨肽原液樣品進行重復性檢驗，按實驗方案：樣品濃度為1.0 g·L-1，培養(yǎng)基血清含量為2.5% FBS，鋪板細胞數(shù)量為5 000 個/孔。進行3次獨立試驗，統(tǒng)計結果并進行評價。

1.7.2中間精密度 選用廠家B(bath No. 1)的骨肽原液樣品進行中間精密度檢驗，3名實驗人員按實驗方案：骨肽原液樣品濃度為1.0 g·L-1，培養(yǎng)基血清含量為2.5% FBS，鋪板細胞數(shù)量為5 000 個/孔。分別進行獨立試驗，統(tǒng)計結果并進行評價。

1.7.3耐用性 選用廠家B(bath No. 1)的骨肽原液樣品進行中間精密度耐用性檢驗，分別考察實驗中一些測定條件的微小變化，包括：不同細胞鋪板密度：4 500、5 000、5 500 個/孔；96孔細胞培養(yǎng)板上藥物作用于不同位置；藥物作用時間：68、72、76 h。測定結果不受影響，以確保方法的可靠性。

1.8 限值及判斷標準的制定取2.3細胞，將13個生產(chǎn)廠家共39批骨肽原液，每孔加入100 μL含1.0 g·L-1骨肽的樣品稀釋液，繼續(xù)培養(yǎng)72 h后測定細胞增殖率。以樣品合格率>60%作為界限，制定骨肽原液的判斷標準。

2 結果

2.1 建立骨肽原液致UMR106細胞增殖方法

2.1.1線性及最低檢測限 骨肽原液藥物濃度在0.06～2.0 g·L-1范圍內(nèi)對UMR106細胞的影響見Fig 1。廠家B(batch No. 1)和C(batch No. 1)的骨肽原液對UMR106細胞有促進增殖作用，在48～72 h、0.06～1.0 g·L-1范圍內(nèi)對UMR106細胞增殖作用呈時間-劑量依賴性，但廠家C的骨肽原液在48 h的2.0 g·L-1濃度劑量增殖呈下降趨勢，骨肽原液對UMR106細胞增殖的最低檢測限為0.06 g·L-1。

Fig 1 UMR106 cell proliferation of bone peptide solution, manufacturers B and C n=2)

2.1.2正交實驗結果 根據(jù)2.3.2計算正交試驗結果，在促UMR106細胞增殖實驗的3個因素影響程度是：骨肽原液濃度>培養(yǎng)基血清含量>細胞數(shù)量。結合顯微鏡下細胞形態(tài)的分析結果，確定骨肽生物活性測定方法-UMR106細胞增殖實驗方案為：骨肽原液濃度為1.0 g·L-1，工作培養(yǎng)基血清含量為2.5% FBS，鋪板細胞數(shù)量為5 000 個/孔。

2.2 方法驗證結果

2.2.1重復性結果 1名檢驗人員獨立對廠家B(bath No. 1)的骨肽原液樣品進行3次實驗，UMR106細胞增殖率均值為247%，RSD=13%，表明此方法的重復性良好，結果見Tab 4。

Tab 4 Repeatability for UMR106 cell proliferation experiment (n=4,%)

2.2.2中間精密度結果 3名實驗人員對廠家B(batch No. 1)的骨肽原液樣品進行1次實驗，按確定方案測定UMR106細胞增殖率，增殖率均值為261%，RSD=16%，表明此方法的中間精密度良好，見Tab 5。

Tab 5 Intermediate precision for UMR106 cell proliferation experiment (n=3,%)

2.2.3耐用性結果 對廠家B(batch No. 1)的骨肽原液樣品，按確定方案測定UMR106細胞增殖率，結果表明：1)不同細胞鋪板密度條件下，增殖率均值為224%，RSD=2%；2)96孔細胞培養(yǎng)板上藥物作用于不同位置條件下，增殖率均值為214%，RSD=5%；3)藥物作用不同時間條件下，增殖率均值為208%，RSD=8%(Tab 6～8)。

Tab 6 Durability for UMR106 cell proliferation experiment (different cell density) (%)

Tab 7 Durability for UMR106 cell proliferation experiment (cell plates in different positions of 96 well) (%)

Tab 8 Durability for UMR106 cell proliferation experiment (drug treated time)

2.3 限值及判定標準的確定13個生產(chǎn)廠家39批骨肽原液中，有8個廠家的骨肽原液促UMR106細胞增殖率≥150%，5個廠家的骨肽原液促UMR106細胞增殖率<150%(Tab 9)。

Tab 9 Proliferation of UMR106 cells by 13 manufacturers (n=6)

3 討論

3.1 質(zhì)量標準和限值建立骨肽原液致UMR106細胞增殖實驗方法，并參照2015年版《中國藥典》9101 藥品質(zhì)量標準分析方法驗證指導原則和9105中藥生物活性測定指導原則，進行重復性、中間精密度、耐用性等方法學驗證[10]，結果表明，骨肽原液促UMR106細胞增殖法重復性、中間精密度和耐用性良好，實驗中一些測定條件的微小變化不會影響細胞增殖率，此方法可靠。且該方法操作簡單，實驗測定結果穩(wěn)定，測定指標與骨肽類制劑藥物的治療作用密切相關，可作為骨肽原液的質(zhì)量評價方法。

結合3.3實驗結果得出骨肽原液致UMR106細胞增殖實驗的結論，以1.0 g·L-1骨肽原液藥物濃度作為限值劑量，增殖率≥150%作為符合規(guī)定的判定標準，樣品合格率>60%，限值劑量及判斷標準制定較合理，其中E、F兩個廠家促UMR106細胞增殖率接近150%，屬于邊緣產(chǎn)品。13個生產(chǎn)廠家骨肽原液不同批次間實驗結果一致，表明實驗方法適用性較好，故可作為骨肽原液生物活性測定方法，以更好的控制產(chǎn)品質(zhì)量。

3.2 骨形成的階段骨形成的過程主要涉及四個階段：骨形成初期成骨細胞數(shù)量明顯增加，而后進入成骨細胞分化階段，細胞外基質(zhì)成熟，骨特征性蛋白表達，促進并參與基質(zhì)礦化，最終完成骨形成。 成骨細胞的數(shù)量決定骨形成的最初速度，大鼠骨肉瘤細胞UMR106在形態(tài)和性質(zhì)上保留有成骨細胞的特征，在骨肽類制劑成骨研究中具有代表性[7-9]。骨肽類制劑的臨床藥理作用有刺激成骨細胞增殖，促進新骨形成，調(diào)節(jié)鈣磷代謝，增加骨鈣沉淀及抗炎、鎮(zhèn)痛等。臨床上主要用于骨質(zhì)疏松癥、骨質(zhì)增生性疾病、骨折及類風濕性關節(jié)炎等治療。成分復雜、活性成分不明確的骨肽類制劑生物活性評價方法的建立應以其最主要的臨床治療功效作為靶點，進行方法學研究，因此筆者選擇骨形成中成骨作用進行了上述研究。

Glu是細胞培養(yǎng)基中常用的添加物，但在UMR106 細胞增殖實驗中，Glu的存在對結果存在影響。因此在使用該法對同類多組分藥物進行生物活性評價研究時，筆者建議應考慮樣品中的Glu含量對實驗的干擾作用。