喬小燕 陳 維 馬成英 陳 棟

(1. 廣東省農(nóng)業(yè)科學院茶葉研究所，廣東 廣州 510640；2. 廣東省茶樹資源創(chuàng)新利用重點實驗室，廣東 廣州 510640)

萎凋是紅茶、綠茶和白茶加工中第一道重要的基礎工序。萎凋過程中既有物理變化，如含水量、葉片狀態(tài)和光澤度[1]，也有化學變化，如咖啡堿、游離氨基酸和糖含量[2]、多酚氧化酶活性[3]。萎凋工序中的物理和化學變化為成品茶外形、滋味、香氣和色澤等的形成奠定基礎。茶葉揮發(fā)性成分依據(jù)嗅感的不同分為兩類，第一類為嗅感為青草氣的脂類降解產(chǎn)物，第二類是類胡蘿卜素和萜類化合物降解產(chǎn)生的嗅感愉快的揮發(fā)性成分。萎凋過程中嗅感為青草氣的揮發(fā)性成分減少，而愉悅的揮發(fā)性成分增加[2]。葉綠素則通過影響脂肪酸、類胡蘿卜素氧化以及萜類代謝相關的衍生途徑，從而影響茶葉香氣[4]。目前，針對萎凋工序的研究主要集中于萎凋過程中生化成分[5]、多酚氧化酶[6]、苯丙氨酸解氨酶[7]和β-葡萄糖苷酶[8]等酶活性變化的研究，萎凋定向調(diào)控技術也是研究的熱點之一[9]。鮮葉萎凋過程中，生化成分和揮發(fā)性成分的變化與適度萎凋是否存在相關性未見報道。研究擬以丹霞8號為試驗材料，比較鮮葉在萎凋過程中主要化學成分和揮發(fā)性成分，探明生化成分和揮發(fā)性成分的變化規(guī)律，通過統(tǒng)計學方法，明晰其與萎凋時間的相關性，為今后科學萎凋提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗材料：丹霞8號，采摘標準為一芽二葉，種植于廣東省仁化縣紅山鎮(zhèn)；

表沒食子兒茶素沒食子酸(EGCG)、兒茶素沒食子酸(CG)、沒食子兒茶素沒食子酸(GCG)、表兒茶素沒食子(ECG)、表兒茶素(EC)、表沒食子兒茶素(EGC)、兒茶素(C)、沒食子兒茶素(GC)、可可堿、茶氨酸和咖啡堿標準品：上海源葉生物科技有限公司；

高效液相色譜儀：Agilent 1200型，配紫外檢測器和色譜工作站，美國安捷倫科技有限公司；

Millipore純水儀：ZMQS5001型，美國密理博公司；

恒溫水浴鍋：HHS型，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；

微量電子天平：FB124型，奧豪斯儀器(常州)有限公司；

紫外—可見分光光度計：752N型，上海菁華科技儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗設計 鮮葉萎凋采用竹篩攤放自然萎凋法，攤?cè)~厚度2.5 cm左右，參考丹霞8號紅茶加工的最適萎凋時間，設置不同的萎凋時間，分別于0，5，9，16，23，26，28，32，50 h取樣，重復3次。樣品采用微波殺青3 min固樣，提香機80 ℃干燥至含水量≤6%。制作的蒸青樣，密封保存于4 ℃冰箱中。采茶和加工期間為多云天氣，氣溫23～26 ℃，相對濕度68%～70%。

1.2.2 主要生化成分測定

(1) 茶多酚：按GB/T 8313—2002執(zhí)行。

(2) 游離氨基酸總量：按GB/T 8314—2013執(zhí)行。

1.2.3 兒茶素組分和生物堿測定 采用HPLC法[10]。

1.2.4 茶氨酸測定 采用HPLC法[11]。

1.2.5 葉綠素和類胡蘿卜素測定 根據(jù)文獻[12]，修改如下：稱取0.5 g茶粉，加入少許碳酸鈣，加入10 mL浸提液在三角瓶中，放在黑暗條件下2 h。濾紙過濾，用80%丙酮對25 mL容量瓶定容。提取液倒入1 cm光徑比色皿內(nèi)，以80%丙酮為空白測吸光度。選擇波長663，646，470 nm。按式(1)計算葉綠素α、葉綠素b和類胡蘿卜素含量。

c1=12.21×OD663 nm-2.81×OD646 nm，

(1)

c2=20.13×OD646 nm-5.03×OD663 nm，

(2)

c3=(1 000×OD470 nm-3.27×c1-104×c2)/229，

(3)

m=c×V×m1×1 000，

(4)

式中：

OD——樣品測試液吸光度；

c1——葉綠素a濃度，mg/L；

c2——葉綠素b濃度，mg/L；

c3——類胡蘿卜素濃度，mg/L；

V——提取體積，L；

m1——樣品質(zhì)量，g；

m——含量，mg/g。

1.2.6 揮發(fā)性成分的測定 采用HS-SPME-GC-MS法[13]，揮發(fā)性成分根據(jù)質(zhì)譜數(shù)據(jù)在標準圖譜數(shù)據(jù)庫NST 14(2014)檢索匹配，并結(jié)合保留時間進行定性。根據(jù)離子流峰面積歸一化法計算各組分在總揮發(fā)物中的相對含量。每個溫度梯度3個重復測定。

1.2.7 數(shù)據(jù)分析 所有數(shù)據(jù)統(tǒng)計及計算均使用Microsoft Excel 2013分析；Graphpad prism 6 軟件繪圖。采用SPSS 25軟件對原始數(shù)據(jù)進行單因素方差分析。SIMCA-P軟件進行主成分分析，并計算各變量的載荷值。

2 結(jié)果與分析

2.1 萎凋過程中生化成分分析

如圖1(a)所示，茶多酚含量在0～23 h顯著增加，23～32 h顯著降低，50 h與16 h茶多酚含量差異不顯著(P<0.05)。游離氨基酸含量0～23 h顯著增加，23～50 h 顯著降低，50 h含量為4.43%(P<0.05)。與Jabeen等[14]對茶鮮葉的研究結(jié)果一致，0～24 h萎凋葉中游離氨基酸含量增加，Dev Choudhary等[15]認為蛋白質(zhì)水解成氨基酸是導致萎凋葉游離氨基酸含量增加的主要原因。茶氨酸占游離氨基酸總量的30%～60%，0～16 h茶氨酸含量顯著降低，16 h茶氨酸含量為1.51%，16～28 h含量差異不顯著，在28～50 h顯著降低(P<0.05)。

如圖1(b)所示，咖啡堿含量在整個萎凋過程中顯著增加，50 h達到最大為7.80%(P<0.05)；可可堿則在0～50 h含量顯著降低，在50 h為0.29%(P<0.05)。Sari等[16]的研究結(jié)果也證實0～8 h茶氨酸含量顯著降低，咖啡堿含量顯著增加，Tomlins等[17]認為萎凋過程中咖啡堿含量的增加與核酸代謝有關。試驗中可可堿含量變化與咖啡堿相反，可可堿的減少是否與咖啡堿含量增加有關，還有待于進一步研究。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)圖1 不同萎凋時間萎凋葉中生化成分分析Figure 1 The chemical component analysis for leaves with different withering time

2.2 萎凋過程中兒茶素組分分析

如表1所示，0～50 h總兒茶素和非酯型兒茶素含量總體顯著下降，酯型兒茶素含量0～32 h差異不顯著，50 h顯著降低到67.84 mg/g(P<0.05)。Ye等[18]則認為，0～21 h非酯型兒茶素含量差異不顯著，酯型兒茶素降低但差異不顯著。0～50 h GC、EGC和EGCG含量降低，與王麗麗等[19]和豐金玉等[20]的研究結(jié)果基本一致，萎凋過程中兒茶素組分降低。兒茶素可在多酚氧化酶和過氧化物酶的氧化聚合下形成兒茶素聚合物。研究證實，萎凋過程中多酚氧化酶和過氧化物酶活性是鮮葉活性的2～4倍[21]，可催化兒茶素形成茶紅素和茶黃素。推測試驗中兒茶素可能在多酚氧化酶和過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化為茶紅素和茶黃素聚合體，導致萎凋葉中總兒茶素和非酯型兒茶素降低。

表1 萎凋葉中兒茶素組分分析?

茶葉中酯型兒茶素可降解為非酯型兒茶素，表型和非表型兒茶素間也是可逆的[22]。5～32 h萎凋葉中GCG和CG含量高于EGCG和ECG可能與兒茶素表型間的轉(zhuǎn)化有關，EGCG和ECG分別轉(zhuǎn)化為GCG和CG。當萎凋時間為50 h，GC保留率最低，為64.02%，EGC的保留率最高為77.80%；EGCG的保留率為67.58%，CG的保留率最高為96.58%。酯型和非酯型兒茶素的保留率基本一致，比例接近1∶1。

2.3 萎凋過程中葉綠素和類胡蘿卜素分析

葉綠素和類胡蘿卜素是影響茶葉香氣質(zhì)和香氣量的重要組分。如圖2所示，萎凋葉葉綠素a含量高于鮮葉，但0～50 h葉綠素a沒有顯著變化(P<0.05)。葉綠素b和類胡蘿卜素含量在0～5 h顯著增加，葉綠素b和類胡蘿卜素在5～28 h含量顯著降低，類胡蘿卜素含量28 h最低，為0.18%；28～50 h顯著增加(P<0.05)。與前人[23-24]的研究結(jié)果一致，萎凋過程中葉綠素和類胡蘿卜素含量減少。蕭偉祥等[25]認為鮮葉在攤放過程中，葉綠素通過葉綠素酶脫去葉綠醇基形成脫葉綠醇基葉綠素，時間越長，脫葉綠醇基反應加強，導致葉綠素b含量降低。與葉綠素b相比，在萎凋過程中類胡蘿卜素含量降低主要是通過非酶促降解[26]。

2.4 萎凋過程中揮發(fā)性成分分析

由表2可知，鮮葉和萎凋葉共檢測到51個揮發(fā)性成分，根據(jù)其化學結(jié)構，可分為萜醇、萜烯、烴類和酯類等13類。水楊酸甲酯是主要的酯類揮發(fā)性成分，在50 h含量最高為10.08%。吲哚是雜環(huán)化合物中主要的揮發(fā)性成分，以5 h含量最高(4.83%)。

由圖3可知，5 h萎凋葉中脂肪醇、雜環(huán)化合物和萜酮相對含量最高，16 h萎凋葉中烴類和萜烯相對含量最高，萜醇相對含量則最低。50 h萎凋葉中酯類、萜醛、芳香醇、芳香醛和萜醇相對含量最高，萜烯相對含量最低。50 h萜烯相對含量是16 h的1/3，50 h萜醇相對含量是16 h的3倍。脂肪酮、脂肪醇、萜酮、芳香醛和芳香醇相對含量在不同萎凋葉中比較穩(wěn)定。

萜烯和萜醇是萎凋葉中主體揮發(fā)性成分，萜烯是5～32 h萎凋葉主體揮發(fā)性成分，萜醇是0 h和50 h萎凋葉主要揮發(fā)性成分。C10萜醇和C10萜烯分別是萜醇和萜烯中主要揮發(fā)性成分。萜烯醇類主要以鍵合態(tài)糖苷形式存在于茶鮮葉，β-葡萄糖苷酶可將鍵合態(tài)糖苷水解，釋放出萜烯醇類揮發(fā)性成分。試驗中τ-萜品烯0～23 h相對含量增加，23～50 h相對含量降低。4-萜品醇0～16 h相對含量降低，16 h最低為6.53%，在23～32 h保持在14%～14.40%，到50 h橙花醇取代4-萜品醇成為主要的揮發(fā)性成分。福鼎大白茶在0～12 h自然萎凋過程中，β-葡萄糖苷酶活性逐步增強，12 hβ-葡萄糖苷酶活性是鮮葉的2.5倍[26]。因此，τ-萜品烯是丹霞8號鮮葉萎凋過程中釋放的主要C10萜烯。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)圖2 萎凋葉中葉綠素和類胡蘿卜素分析Figure 2 The chlorophyll and carotenoids analysis in withering leaves

2.5 主成分分析

2.5.1 生化成分、葉綠素和類胡蘿卜素的主成分分析

以茶多酚、茶氨酸、兒茶素組分、葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素等16個成分為變量，進行主成分分析。由圖4和表3可知，PC1、PC2和PC3解釋了所有變量的81.83% 原始變異信息，在PC1上，0～16 h和23～50 h區(qū)分開[圖4(a)]。變量載荷值可知，GC、EGCG和EGC載荷值為正，對PC1有正向作用。在PC3上進一步區(qū)分為：0，5～16，23～28，32～50 h，葉綠素a、類胡蘿卜素和CG對PC3有正向作用。

圖3 揮發(fā)性成分分類和相對含量分析Figure 3 Category and relative content of the volatile of different withering leaves

表2 萎凋葉中揮發(fā)性成分相對含量分析

續(xù)表2

由上可知，16 h和23 h是鮮葉萎凋過程中內(nèi)含物成分變化的分界點，GC、EGCG、EGC對0～16 h萎凋葉的生化特征有決定作用；葉綠素a和GCG對23～28 h萎凋葉的生化特征有積極作用；葉綠素a和類胡蘿卜素對32～50 h萎凋葉生化特征有積極作用。因此，不同萎凋階段，對萎凋葉生化特征起決定作用的成分不同。

2.5.2 揮發(fā)性成分的主成分分析 以表2中的51個揮發(fā)性成分為變量，進行主成分分析。由圖5和表4可知，PC1、PC2和PC3解釋了揮發(fā)性成分83.52%原始變異信息。在PC1上，0～32，16，50 h明顯區(qū)分開，16 h和50 h的香氣輪廓則迥異于其他萎凋時間。β-水芹烯、α-萜品烯和α-水芹烯對PC1有正向作用、α-萜品醇和橙花醇對PC1有負向作用。在PC3上，0～23 h進一步區(qū)分為兩個不同的香氣輪廓，0～9 h和16～23 h的香氣輪廓不同，脫氫芳樟醇、1-(1,4-二甲基-3-環(huán)己烯-1-基)乙酮、順-茉莉酮、2-乙基-1-己醇和1-乙基-2-甲酰吡咯對PC3有正向作用，是引起0～9 h香氣輪廓發(fā)生變化的主要原因。

圖4 生化成分、葉綠素和類胡蘿卜素的PCA分析Figure 4 The principal component analysis based on chemical components,chlorophyll and carotenoids

表3 3個主成分中載荷值(絕對值)前3個的變量?

圖5 揮發(fā)性成分PCA分析Figure 5 The principal component analysis of the whole volatile

表4 3個主成分中載荷值(絕對值)前5個揮發(fā)性成分

由上可知，16 h和23 h是萎凋過程中香氣輪廓變化的分界點；β-水芹烯、α-萜品烯和α-水芹烯對16 h萎凋葉香氣輪廓有積極作用；癸醛和苯甲醛是影響23 h萎凋葉香氣輪廓的最重要成分；α-萜品醇、橙花醇和癸醛、苯甲醛對26～32 h萎凋葉香氣輪廓有決定作用；α-萜品醇、橙花醇、2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚、4-萜品醇、4-異丙基-1-甲基-2-環(huán)己烯-1-醇對50 h萎凋葉香氣輪廓有決定作用。

3 結(jié)論

萎凋過程中丹霞8號萎凋葉生化成分特征和香氣輪廓呈規(guī)律性變化，且各個階段差異明顯。16 h和23 h是鮮葉萎凋過程中生化成分特征和香氣輪廓發(fā)生改變的關鍵時間點。萎凋時間為16～23 h時，萎凋葉生化成分特征和香氣輪廓保持一致，與實際生產(chǎn)中的適度萎凋程度所需時間基本一致。生化成分(GC、EGC、EGCG、GCG、葉綠素a)和揮發(fā)性成分(β-水芹烯、α-萜品烯、α-水芹烯、癸醛和苯甲醛)可作為綜合判別萎凋程度的重要指標。