馮 瑩 林慶良 潘東明

(1. 泉州師范學(xué)院資源與環(huán)境學(xué)院 泉州 362000； 2. 福建農(nóng)林大學(xué) 福州 350002)

離體保存自1975年由Henshaw和Morel首次提出后，以其占用空間小、無(wú)菌培養(yǎng)、人工和經(jīng)費(fèi)少、易于交流等優(yōu)點(diǎn)(Villalobosetal.， 1995； Rayetal.， 2010； Engelmann， 2011； Vasanthetal.， 2011)，現(xiàn)已被應(yīng)用于多種植物種質(zhì)資源的離體保存，如： 半夏(Pinelliaternata)(劉修樹(shù)等， 2018)、地楓皮(Illiciumdifengpi)(張樂(lè)等， 2015)、木薯(Manihotesculenta)(黎萍等， 2015)、菊花(Chrysanthemummorifolium)(王小樂(lè)等， 2019a； 2019b)。通過(guò)在培養(yǎng)基內(nèi)添加生長(zhǎng)抑制劑(劉連軍等， 2016)、調(diào)節(jié)滲透壓(Panetal.， 2014； Renzendeetal.， 2018； Nasiruddinetal.， 2018)等方法限制培養(yǎng)物生長(zhǎng)，從而延長(zhǎng)繼代時(shí)間，實(shí)現(xiàn)植物的離體保存。但是，由于遺傳變異的存在，保存材料及其與原先種苗的遺傳穩(wěn)定性檢測(cè)也是十分必要的。目前，可通過(guò)細(xì)胞學(xué)、分子標(biāo)記等方法檢測(cè)保存材料的遺傳穩(wěn)定性。簡(jiǎn)單重復(fù)序列(simple sequence repeat，SSR)是第二代分子標(biāo)記技術(shù)，具有多樣性高、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)也被廣泛地用于分析植物離體保存材料的遺傳穩(wěn)定性。

青錢柳(Cyclocaryapaliurus)屬于胡桃科(Juglandaceae)青錢柳屬(Cyclocarya)，是我國(guó)獨(dú)有的單種屬喬木植物，主要分布在江西、浙江、湖南、福建、四川等地山區(qū)(方升佐等， 2007)。現(xiàn)存的青錢柳以天然林為主，自然條件下，青錢柳繁殖能力弱，林下幼苗少(方升佐等， 2003)，且隨著其藥用價(jià)值的發(fā)掘，青錢柳天然林受到嚴(yán)重破壞。故而，青錢柳種質(zhì)資源的保存就顯得十分必要。

愈傷組織是適宜的離體保存材料。近年來(lái)，研究者們主要針對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)與分化、易褐化等問(wèn)題開(kāi)展青錢柳離體培養(yǎng)的研究，初步建立了良好的愈傷組織誘導(dǎo)、分化體系(Huetal.， 2010； 謝寅峰等， 2011； 阮氏釧等， 2014； 吳玲利等， 2019)，并有效解決了愈傷組織褐化問(wèn)題(馮瑩等， 2019)，但關(guān)于青錢柳愈傷組織離體保存的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。

本文以青錢柳愈傷組織為離體保存材料，在優(yōu)化植物激素的基礎(chǔ)上，通過(guò)添加滲透調(diào)節(jié)劑和生長(zhǎng)抑制劑，探索出青錢柳愈傷組織離體保存的方法，并結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)和SSR分子標(biāo)記技術(shù)檢測(cè)愈傷組織的遺傳穩(wěn)定性，以期為青錢柳種質(zhì)資源的長(zhǎng)期離體保存提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為青錢柳愈傷組織，該類愈傷組織呈黃綠色或綠色、顆粒小、表面干爽，是由葉片(來(lái)自福建永春種源)誘導(dǎo)的。

1.2 愈傷組織離體保存試驗(yàn)

挑取新鮮且生長(zhǎng)一致的愈傷組織，培養(yǎng)于保存培養(yǎng)基(除特殊說(shuō)明外，保存培養(yǎng)基組成為： 改良MS基本培養(yǎng)基、0.8 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1IBA、30 g·L-1蔗糖、6.0 g·L-1瓊脂粉，pH5.8)。每瓶接種0.5 g愈傷組織(共4團(tuán))，每10瓶為一個(gè)組合，重復(fù)3次。稱取不同保存時(shí)間段內(nèi)愈傷組織的鮮質(zhì)量，統(tǒng)計(jì)增殖倍數(shù)和死亡率，并觀察生長(zhǎng)狀態(tài)。

采用日光燈為培養(yǎng)光源，培養(yǎng)條件為光照強(qiáng)度283.02 μmol·m-2s-1，光照時(shí)間為每天12 h，培養(yǎng)溫度為(20±1)℃。

1.2.1 6-BA+IBA組合對(duì)愈傷組織離體保存的影響 采用二因素完全隨機(jī)試驗(yàn)法，試驗(yàn)了保存培養(yǎng)基中6-BA+IBA濃度組合(6-BA濃度為0.4、0.6、0.8、1.0 mg·L-1； IBA濃度為0.2、0.4 mg·L-1)對(duì)愈傷組織離體保存的影響。

①優(yōu)：腰痛、腿痛均消失，腰部運(yùn)動(dòng)無(wú)限制，可正常生活及工作。②良：腰痛、腿痛顯著改善，腰部運(yùn)動(dòng)無(wú)限制，可進(jìn)行輕微的工作。③可：腰痛、腿痛有所好轉(zhuǎn)，但不能獨(dú)立活動(dòng)及工作。④差：腰痛、腿痛、運(yùn)動(dòng)功能等無(wú)改善，或加重。

1.2.2 蔗糖濃度和保存時(shí)間對(duì)愈傷組織離體保存的影響 采用單因素完全隨機(jī)試驗(yàn)方法，針對(duì)保存培養(yǎng)基中添加不同蔗糖濃度(30、45、50、55、60 g·L-1)進(jìn)行愈傷組織離體保存試驗(yàn)。針對(duì)保存培養(yǎng)基內(nèi)添加不同蔗糖濃度(30、45、50、55 g·L-1)，進(jìn)一步比較不同保存時(shí)間(60、90、120、150、180 天)對(duì)愈傷組織離體保存的影響。

1.2.3 滲透調(diào)節(jié)劑對(duì)愈傷組織離體保存的影響 采用單因素完全隨機(jī)試驗(yàn)方法，針對(duì)保存培養(yǎng)基中添加不同種類和濃度的滲透劑(甘露醇： 0、10、20、30、40、50 g·L-1； 肌醇： 0、10、20、30、40、50 g·L-1)進(jìn)行愈傷組織離體保存試驗(yàn)。

1.2.4 生長(zhǎng)抑制劑對(duì)愈傷組織離體保存的影響 采用單因素完全隨機(jī)試驗(yàn)方法，針對(duì)保存培養(yǎng)基內(nèi)添加不同種類和濃度的生長(zhǎng)抑制劑(多效唑(PP333)： 0、2、4、6、8、10 mg·L-1； 丁酰肼(B9)： 0、2、4、6、8、10 mg·L-1)進(jìn)行愈傷組織的離體保存試驗(yàn)。

1.3 離體保存的愈傷組織恢復(fù)生長(zhǎng)和遺傳穩(wěn)定性

將黃綠色、顆粒狀且顆粒小而疏松的愈傷組織(Ⅱ類型愈傷組織，離體保存培養(yǎng)基中培養(yǎng))在改良MS+0.8 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1IBA+45 g·L-1蔗糖+6.0 g·L-1瓊脂粉(pH5.8)離體保存培養(yǎng)基內(nèi)進(jìn)行離體保存，繼代保存周期為90天，每繼代1次記為一代。隨機(jī)挑取不同保存代數(shù)的愈傷組織(增殖培養(yǎng)的愈傷組織T0、保存第1、3、5、7、9、11、13、15代的愈傷組織T1、T3、T5、T7、T9、T11、T13、T15)，分別進(jìn)行細(xì)胞倍性分析和遺傳穩(wěn)定性分析。

1.3.1 恢復(fù)生長(zhǎng) 取保存第15代的部分Ⅱ類愈傷組織重新接入增殖培養(yǎng)基(改良MS+0.5 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1NAA +30 g·L-1蔗糖+6.0 g·L-1瓊脂粉，pH5.8)和分化培養(yǎng)基(待發(fā)表，成分包括改良MS+6-BA+IAA+蔗糖+瓊脂粉，pH5.8)，進(jìn)行恢復(fù)生長(zhǎng)培養(yǎng)。

1.3.2 細(xì)胞倍性分析 以葉片(來(lái)源于福建永春種源)為對(duì)照(CK)，采用流式細(xì)胞術(shù)法檢測(cè)不同保存代數(shù)的愈傷組織(T1、T3、T7、T11、T15)細(xì)胞的倍性。采用Partec CyStain UV Precise P試劑盒提取愈傷組織DNA后，于流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞倍性。

1.3.3 SSR分子標(biāo)記技術(shù)檢測(cè)遺傳穩(wěn)定性 采用CTAB法，分別提取葉片(對(duì)照，來(lái)源于福建永春種源)和不同保存代數(shù)的愈傷組織(T0、T1、T3、T5、T7、T9、T11、T13、T15)DNA，利用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA 的完整性。參照Fan等(2013)的方法，篩選出4對(duì)引物，引物序列分別為： F1-F： 5′-ATTCCCC ACCCCCATCTC-3′，F(xiàn)1-R： 5′-CTCCTCCAGCGCAC ATAA-3′； F2-F： 5′-AGATGGCTTTTCAGATTTG-3′，F(xiàn)2-R： 5′-CGGAAACTTGAATCAGAG-3′； F3-F： 5′-CTGGCACGCACAATACAC-3′，F(xiàn)3-R： 5′-CCAAAAA GGGTTGAGCTT-3′； F4-F： 5′-TCCTCCACTTCCAATG AT-3′，F(xiàn)4-R： 5′-AGAGGAGCAAACAAACAT-3′。

采用SSR分子標(biāo)記技術(shù)分析不同保存代數(shù)愈傷組織的遺傳穩(wěn)定性。以DNA為模板進(jìn)行SSR-PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用6%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)，經(jīng)銀染后拍照觀察。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

增殖倍數(shù)=轉(zhuǎn)接的愈傷組織總瓶數(shù)/原培養(yǎng)的愈傷組織總瓶數(shù)； 愈傷組織的死亡率(%)=死亡的愈傷組織總團(tuán)數(shù)/原愈傷組織總團(tuán)數(shù)×100%； 愈傷組織凈增長(zhǎng)量(g)=60天愈傷組織鮮質(zhì)量-0.5。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理對(duì)愈傷組織離體保存的影響

2.1.1 離體保存的愈傷組織生長(zhǎng)情況 觀察愈傷組織在離體保存培養(yǎng)基的生長(zhǎng)情況表明： 在保存60天內(nèi)，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，愈傷組織在各類離體保存培養(yǎng)基內(nèi)均可以繁殖(表1)，表現(xiàn)為不同的質(zhì)地： Ⅰ類愈傷組織呈粉紅色或紅色，粉末狀或顆粒狀，質(zhì)地疏松(圖1A、B)； Ⅱ類愈傷組織呈黃綠色，顆粒狀，顆粒小而疏松(圖1C、D)； Ⅲ類愈傷組織呈米白色，團(tuán)塊狀或粉末狀，質(zhì)地疏松(圖1E、F)。

表1 愈傷組織在離體保存培養(yǎng)基內(nèi)的質(zhì)地表現(xiàn)Tab.1 The growth of callus cultured in the different conservation medium

圖1 愈傷組織保存類型Fig.1 The type of callus in vitro conservation in C. paliurusA, B: I類型愈傷組織; C, D: II類型愈傷組織; E, F: III類型愈傷組織。 A, B: Type Ⅰcallus; C, D: Type Ⅱcallus; E, F: Type Ⅲcallus.

2.1.2 6-BA+IBA濃度組合對(duì)愈傷組織離體保存的影響 青錢柳愈傷組織離體保存60天時(shí)，添加0.8 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1IBA組合效果較好，愈傷組織死亡率為0，且生長(zhǎng)較為緩慢，增殖倍數(shù)為3.52倍，與同為零死亡的0.6 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1IBA組合達(dá)到顯著性差異(表2)。當(dāng)保存90天時(shí)，愈傷組織的死亡率均達(dá)到50%以上。

表2 6-BA+IBA對(duì)青錢柳愈傷組織離體保存的影響①Tab.2 The effect of 6-BA and IBA on in vitro callus conservation in C. paliurus

2.1.3 不同蔗糖濃度及其保存時(shí)間對(duì)愈傷組織離體保存的影響 試驗(yàn)結(jié)果(圖2)表明： 保存60天時(shí)，與添加30 g·L-1蔗糖(對(duì)照組)相比，添加45～55 g·L-1蔗糖可有效地抑制愈傷組織生長(zhǎng)，其鮮質(zhì)量?jī)粼鲩L(zhǎng)量和增殖倍數(shù)逐漸降低，與對(duì)照組達(dá)到顯著性差異，死亡率為0； 當(dāng)蔗糖濃度為60 g·L-1時(shí)，愈傷組織鮮質(zhì)量?jī)粼鲩L(zhǎng)量和增殖倍數(shù)為最低，但死亡率達(dá)到22.22%。

圖2 不同蔗糖濃度對(duì)青錢柳愈傷組織離體保存的影響Fig.2 The effect of different sugar content on in vitro callus conservation in C. paliurus

進(jìn)一步針對(duì)不同保存時(shí)間對(duì)愈傷組織離體保存影響的試驗(yàn)結(jié)果(表3)表明： 與添加30 g·L-1蔗糖(對(duì)照組)相比，添加45～55 g·L-1蔗糖保存60 天時(shí)，愈傷組織存活率均達(dá)到100%； 隨保存時(shí)間的延長(zhǎng)和蔗糖濃度升高，愈傷組織存活率逐漸降低。添加45 g·L-1蔗糖保存90 天時(shí)，愈傷組織存活率100%，與其他處理差異顯著，愈傷組織質(zhì)地為Ⅱ類型。

表3 不同保存時(shí)間對(duì)青錢柳愈傷組織離體保存的影響
Tab.3 The effect of different days oninvitrocallus conservation inC.paliurus

蔗糖濃度Sugar content/(g·L-1)存活率Survival rate(%)60 d90 d120 d150 d180 d30 100±0 a79.33±3.06 c24.00±4.00 d0±0 d0±0 b45 100±0 a100±0 a74.67±3.06 a38.00±4.00 a14.00±6.00 a50100±0 a88.67±3.06 b57.33±6.11 b26.67±3.06 b0±0 b55100±0 a68.00±3.00 d40.00±2.00 c14.00±4.00 c0±0 b

2.1.4 甘露醇對(duì)愈傷組織離體保存的影響 青錢柳愈傷組織離體保存60天時(shí)，與添加0 g·L-1甘露醇(對(duì)照組)相比，添加10～50 g·L-1甘露醇保存的愈傷組織生長(zhǎng)緩慢，其鮮質(zhì)量?jī)粼鲩L(zhǎng)量和增殖倍數(shù)呈顯著性降低(圖3A)，死亡率逐漸升高(圖3B)。當(dāng)保存90天時(shí)，10 g·L-1甘露醇保存的愈傷組織存活率為66.67%，其余濃度保存的愈傷組織死亡率均達(dá)到90.00%以上。

2.1.5 肌醇對(duì)愈傷組織離體保存的影響 青錢柳愈傷組織離體保存60天時(shí)，與添加0 g·L-1肌醇(對(duì)照組)相比，添加10～50 g·L-1肌醇保存的愈傷組織鮮質(zhì)量?jī)粼鲩L(zhǎng)量和增殖倍數(shù)均先升高后降低(圖4 A)，但死亡率逐漸升高(圖4B)； 當(dāng)保存90天時(shí)，愈傷組織死亡率均達(dá)到100%。

圖3 不同甘露醇濃度對(duì)青錢柳愈傷組織離體保存的影響Fig.3 The effect of mannitol content on in vitro callus conservation in C. paliurus

圖4 不同肌醇濃度對(duì)青錢柳愈傷組織離體保存的影響Fig.4 The effect of inositol content on in vitro callus conservation in C. paliurus

2.1.6 多效唑?qū)τ鷤M織離體保存的影響 青錢柳愈傷組織離體保存60天時(shí)，與添加0 mg·L-1多效唑(對(duì)照組)相比，添加2～10 mg·L-1多效唑保存的愈傷組織鮮質(zhì)量?jī)粼鲩L(zhǎng)量和增殖倍數(shù)顯著降低(圖5A)，但死亡率逐漸升高(圖5B)； 保存90天時(shí)，愈傷組織死亡率均達(dá)100%。

2.1.7 丁酰肼對(duì)愈傷組織離體保存的影響 青錢柳愈傷組織離體保存60天時(shí)，與添加0 mg·L-1丁酰肼(對(duì)照組)相比，添加2～10 mg·L-1丁酰肼可有效地抑制愈傷組織生長(zhǎng)，愈傷組織鮮質(zhì)量?jī)粼鲩L(zhǎng)量和增殖倍數(shù)先升高后降低(圖6A)，但死亡率逐漸升高(圖6B)； 當(dāng)保存90天時(shí)，愈傷組織死亡率均達(dá)到100%。

圖5 不同多效唑濃度對(duì)青錢柳愈傷組織離體保存的影響Fig.5 The effect of PP333 on in vitro callus conservation in C. paliurus

圖6 不同丁酰肼濃度對(duì)青錢柳愈傷組織離體保存的影響Fig.6 The effect of B9 content on in vitro callus conservation in C. paliurus

綜合蔗糖處理、滲透調(diào)節(jié)劑處理和生長(zhǎng)抑制劑處理的結(jié)果表明： 適宜于愈傷組織的離體保存培養(yǎng)基為改良MS+0.8 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1IBA+45 g·L-1蔗糖+6.0 g·L-1瓊脂粉，pH5.8，適宜的繼代保存周期為90天，愈傷組織質(zhì)地為II類型。

2.2 離體保存的愈傷組織遺傳穩(wěn)定性分析

2.2.1 恢復(fù)生長(zhǎng)培養(yǎng) 恢復(fù)生長(zhǎng)培養(yǎng)40天觀察發(fā)現(xiàn)： 愈傷組織均能恢復(fù)生長(zhǎng)，與T0在形態(tài)、生活力和生長(zhǎng)勢(shì)上沒(méi)有差異(圖7A、B)，并能夠分化(圖7C、D)。

2.2.2 不同保存代數(shù)愈傷組織細(xì)胞倍性的分析 對(duì)不同保存代數(shù)的愈傷組織細(xì)胞倍性檢測(cè)結(jié)果表明： 與對(duì)照(葉片)相比，不同保存代數(shù)的愈傷組織細(xì)胞倍性沒(méi)有發(fā)生改變(圖8)，沒(méi)有發(fā)生遺傳性變異。

圖7 青錢柳愈傷組織恢復(fù)生長(zhǎng)Fig.7 Recovery growth of callus in vitro conservationA: T0代愈傷組織(對(duì)照); B: 保存15代后恢復(fù)生長(zhǎng)的愈傷組織; C, D: 恢復(fù)生長(zhǎng)的愈傷組織分化。A: Callus growth of T0 (control); B: Recovery growth of callus in vitro conservation (T15); C, D: Differentiation of callus after recovery growth.

圖8 不同保存代數(shù)愈傷組織的細(xì)胞倍性檢測(cè)Fig.8 Analysis of cell ploidy of different conservation time of callus in vitro conservationA: 葉片的細(xì)胞倍性(對(duì)照); B-F: 分別為保存第1、3、7、11、15代愈傷組織的細(xì)胞倍性; FL4: 熒光強(qiáng)度。A: Cell ploidy of leaf (CK); B-F: Cell ploidy of callus in vitro conservation(T1, T3, T7, T11, T15); FL4: Fluorescence intensity.

2.2.3 SSR分子標(biāo)記技術(shù)檢測(cè)不同保存代數(shù)愈傷組織的遺傳穩(wěn)定性 與葉片(對(duì)照)相比，不同保存代數(shù)的愈傷組織擴(kuò)增圖譜沒(méi)有產(chǎn)生特異性條帶(圖9)。這說(shuō)明保存材料穩(wěn)定性好，沒(méi)有發(fā)生遺傳變異。

3 討論

利用培養(yǎng)基的高滲透壓抑制離體保存材料的生長(zhǎng)，是植物離體保存的方法之一。通過(guò)添加蔗糖和甘露醇等滲透調(diào)節(jié)劑來(lái)提高培養(yǎng)基的滲透壓，可抑制培養(yǎng)材料對(duì)水分和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收(Holobiuc, 2015； Thakuretal., 2015； Gomesetal., 2017； Vettorazzietal., 2017)，從而起到抑制離體材料的生長(zhǎng)，實(shí)現(xiàn)離體保存的目的。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，保存培養(yǎng)基中添加適量的蔗糖(45～55 g·L-1)能有效地抑制愈傷組織的生長(zhǎng)，但蔗糖(30 g·L-1)和甘露醇(≥10 g·L-1)組合、高濃度蔗糖(≥60 g·L-1)隨著保存時(shí)間的延長(zhǎng)均會(huì)導(dǎo)致青錢柳愈傷組織的死亡率增加。這同黎萍等(2015)、劉修樹(shù)等(2018)、Muňoz等(2019)、王小樂(lè)等(2019a)、Pan等(2014)的研究結(jié)果一致。Nasiruddin等(2018)指出甘露醇和蔗糖組合有利于馬鈴薯(Solanumtuberosum)的離體保存，與本研究的結(jié)果不一致，這可能是由于不同植物離體保存的途徑不同(Duetal.， 2012)。

培養(yǎng)基中添加植物生長(zhǎng)抑制劑(如： 多效唑、丁酰肼)以減緩培養(yǎng)物的生長(zhǎng)可實(shí)現(xiàn)植物離體保存(黎萍等， 2015； 劉連軍等， 2016)。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，多效唑和丁酰肼雖然能明顯地抑制愈傷組織的生長(zhǎng)，但保存時(shí)間較短(≤60天)，且隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，愈傷組織的死亡率增加，不適宜作為愈傷組織離體保存生長(zhǎng)抑制劑。這同黎萍等(2015)、史芳芳(2015)的研究結(jié)果一致。但劉連軍等(2016)指出PP3331.0～1.5 mg·L-1、B90.5～1.0 mg·L-1可以有效地延長(zhǎng)木薯(Manihotesculenta)試管苗保存時(shí)間，提高存活率，是對(duì)木薯種質(zhì)資源離體保存方法之一。這可能是由于植物生長(zhǎng)抑制劑對(duì)不同離體保存材料的延緩作用表現(xiàn)不同。

圖9 不同保存代數(shù)青錢柳愈傷組織的SSR分子標(biāo)記Fig.9 Identification of in vitro callus conservation for different cultural time with SSR marker in C. paliurus1-11、12-22、23-33、34-44分別為F1、F2、F3、F4引物標(biāo)記的SSR擴(kuò)增產(chǎn)物； 每組樣品依次為葉片(來(lái)源于福建永春種源)、不同代數(shù)的愈傷組織(T0、T1、T3、T5、T7、T9)、葉片(來(lái)源于江西井岡山種源)、不同代數(shù)的愈傷組織(T11、T13、T15)。1-11, 12-22, 23-33 and 34-44 mean SSR products with leaf from FujianYongchun, callus in vitro conservation from T0, T1, T3, T5, T7 and T9, leaf from Jiangxi Jinggangshan, callus in vitro conservation from T11, T13 and T15 by F1, F2, F3, F4, respectively.

離體保存是植物優(yōu)良種質(zhì)資源保存的一種較好手段，但離體保存時(shí)必須時(shí)刻關(guān)注其離體保存材料的遺傳穩(wěn)定性。本試驗(yàn)采用SSR分子標(biāo)記技術(shù)和流式細(xì)胞術(shù)對(duì)不同保存代數(shù)的青錢柳愈傷組織遺傳穩(wěn)定性的檢測(cè)結(jié)果表明，不同保存代數(shù)愈傷組織均未發(fā)生變異，遺傳穩(wěn)定性好。李曉艷等(2009)、白建明等(2010)、尹明華等(2015)、王小樂(lè)等(2019b)對(duì)越橘(Vacciniumspp.)、馬鈴薯、紅芽芋(Colocasiaesculentavar.cormosuscv. Hongyayu)、菊花離體保存有類似的結(jié)果。

4 結(jié)論

在青錢柳保存培養(yǎng)基中添加生長(zhǎng)抑制劑多效唑和丁酰肼及滲透調(diào)節(jié)劑甘露醇和肌醇均能抑制青錢柳愈傷組織生長(zhǎng)，但不利于青錢柳愈傷組織的離體保存； 適宜的青錢柳愈傷組織離體保存的培養(yǎng)基為改良MS基本培養(yǎng)基+0.8 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1IBA+45 g·L-1蔗糖+6.0 g·L-1瓊脂粉，pH5.8，該培養(yǎng)基可有效地限制青錢柳愈傷組織生長(zhǎng)； 在(20±1)℃下每隔90天轉(zhuǎn)接1次，是青錢柳愈傷組織離體保存繼代的最佳途徑。該途徑下離體保存的愈傷組織能恢復(fù)生長(zhǎng)和分化，遺傳穩(wěn)定性好，未發(fā)生變異。