謝 憲 梁 軍,2 朱彥鵬 胡瑞瑞 程 元 張星耀,2

(1. 中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院森林生態(tài)環(huán)境與保護(hù)研究所 國(guó)家林業(yè)和草原局森林保護(hù)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 北京 100091; 2. 昆崳山森林生態(tài)系統(tǒng)國(guó)家定位觀測(cè)研究站 煙臺(tái) 264100; 3. 中國(guó)環(huán)境科學(xué)研究院 北京 100012)

松球殼孢菌(Sphaeropsissapinea)可引起針葉樹(shù)種的枯梢病(Blodgettetal., 2005)。枯梢病的發(fā)生會(huì)影響多種針葉樹(shù)的生長(zhǎng)發(fā)育，尤其是松屬(Pinusspp.)，已造成了重大生態(tài)破壞和經(jīng)濟(jì)損失(Stanoszetal.,1996)。經(jīng)CABI統(tǒng)計(jì)，松球殼孢菌是世界上65個(gè)國(guó)家最常見(jiàn)的真菌類(lèi)植物病原體之一(CABI, 2017)，目前已知松球殼孢菌廣泛分布于北半球的松樹(shù)自然分布區(qū)，這些樹(shù)木已被引種至南半球(Smithetal., 2006)。松枯梢病已在我國(guó)中南、西南、華南、華東、西北等10余個(gè)省份的松林中發(fā)生，對(duì)松樹(shù)林造成了嚴(yán)重的危害(葉建仁等, 2011)。

內(nèi)生真菌在植物體內(nèi)度過(guò)其全部或部分生命周期。當(dāng)被定義為內(nèi)生微生物時(shí)，這些菌種可能并不會(huì)對(duì)寄主植物造成直接傷害(Backmanetal., 2008; Rodriguezetal., 2009)，而且在某些情況下，內(nèi)生菌對(duì)寄主會(huì)產(chǎn)生有益的影響(Arnold, 2007)。內(nèi)生微生物通過(guò)種子從大樹(shù)垂直傳播到幼樹(shù)，并在葉和莖系統(tǒng)中生長(zhǎng)(Santangeloetal., 2015)，通過(guò)有性孢子或無(wú)性孢子水平傳播(Arnoldetal., 2003)。已有研究表明，內(nèi)生真菌在與寄主植物和其他內(nèi)生微生物的互作中，能抵抗對(duì)植物病原菌的入侵，提高寄主植物的抗病性(Pakvazetal., 2016)。因此，植物內(nèi)生微生物的群落結(jié)構(gòu)的研究有利于解析寄主植物—病原菌—內(nèi)生菌三者間的關(guān)系，對(duì)病害的預(yù)防和調(diào)控具有指導(dǎo)意義。

目前，關(guān)于松球殼孢菌侵染的研究主要集中在病原菌定殖和物種鑒定(Luchietal., 2014; Adamsonetal., 2015)、感染針葉的生化生理相應(yīng)、激素和抗氧化代謝的變化(Huetal., 2018)和寄主抗性(Sherwoodetal., 2013)等方面。對(duì)感染松球殼孢菌的松樹(shù)寄主的內(nèi)部微生物，特別是病原菌影響的真菌多樣性和群落結(jié)構(gòu)的變化還未有研究。鑒于此，本研究選擇無(wú)病斑與感染枯梢病不同發(fā)病情況的赤松(Pinusdensiflora)針葉為研究對(duì)象，利用高通量測(cè)序技術(shù)研究不同枯梢病發(fā)病狀態(tài)下赤松針葉的內(nèi)生真菌多樣性以及群落結(jié)構(gòu)的差異，為松枯梢病的微生物防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況及樣地設(shè)置

昆崳山(121°41′34″—121°48′04″E，37°11′50″—37°17′49″N)地處山東半島東部，屬暖溫帶季風(fēng)氣候，林區(qū)土壤屬森林棕壤，以沙質(zhì)壤土為主。昆崳山是我國(guó)赤松原生地和天然分布中心，分布面積達(dá)11 546.3 hm2。共選取3塊30 m×30 m標(biāo)準(zhǔn)樣地(樣地P，海拔212 m；樣地Q，海拔196 m；樣地R，海拔185 m)。樣地立地條件均為中坡位，坡度為24°～26°，林分均為赤松純林，赤松占比超過(guò)80%。

1.2 樣品采集

2018年9月，在3塊純林樣地內(nèi)進(jìn)行采樣，由于枯梢病病原菌存在潛伏侵染的情況以及針葉不同發(fā)病情況，因此分別采集樣地內(nèi)全株無(wú)病斑赤松的針葉CC1(P1、Q1、R1)與染病赤松上無(wú)病斑針葉CC2(P2、Q2、R2)、染病較輕針葉CC3(病斑長(zhǎng)度為針葉長(zhǎng)度1/2以下,P3、Q3、R3)、染病較重針葉CC4(病斑長(zhǎng)度為針葉長(zhǎng)度1/2以上，P4、Q4、R4)。采用五點(diǎn)采樣法采集樣本，沖洗晾干后用75%乙醇浸泡1 min，無(wú)菌水沖洗3次，0.5%次氯酸鈉溶液浸泡2 min后，再用無(wú)菌水沖洗3次，-20°C條件下保存(劉學(xué)周等, 2015)。將沖洗后的無(wú)菌水稀釋至PDA培養(yǎng)基上，置于適宜條件下進(jìn)行培養(yǎng)，經(jīng)7天觀察后，培養(yǎng)基內(nèi)無(wú)真菌生長(zhǎng)，證實(shí)針葉樣本表面已無(wú)殘留真菌。

1.3 真菌多樣性測(cè)定

利用CTAB法對(duì)樣本DNA進(jìn)行抽提，完成基因組DNA抽提后，利用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)(Bullingtonetal., 2015)。將DNA樣品在冰上融化后，離心并充分混勻，Nanodrop檢測(cè)樣品質(zhì)量，取30 ng進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系： DNA樣品，1.0 μL； Forward Primer(5.0 μmol·L-1)，1.0 μL； Reverse Primer(5.0 μmol·L-1)，1.0 μL； BSA(2.0 ng·μL-1)，3.0 μL； 2 × Taq Plus Master Mix，12.5 μL； ddH2O，6.5 μL。進(jìn)行ITS擴(kuò)增。ITS1區(qū)擴(kuò)增引物序列為(5′-CTTGGTCATTTAG AGGAAGTAA-3’)和(5′-TGCGTTCTTCATCGAT GC-3′)。

PCR采用TransGen AP221-02： TransStart Fastpfu DNA Polymerase，將同一樣本的PCR產(chǎn)物混合后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，使用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒(AXYGEN公司)切膠回收PCR產(chǎn)物，Tris-HCl洗脫，2%瓊脂糖電泳檢測(cè)。擴(kuò)增產(chǎn)物采用Illumina Miseq PE300平臺(tái)，并構(gòu)建Miseq文庫(kù)以及Miseq上機(jī)測(cè)序。

1.4 測(cè)序數(shù)據(jù)處理與分析

OTU(operational taxonomic units)是在系統(tǒng)發(fā)生學(xué)或群體遺傳學(xué)研究中為了便于進(jìn)行分析，為某一個(gè)分類(lèi)單元(品系、屬、種、分組等)設(shè)置的同一標(biāo)志。用uclust(Version 1.2.22)按照97%相似性將全部序列聚類(lèi)，去除singleton的OTU，并得到代表序列和OTU表。用usearch按照97%相似性序列進(jìn)行OTU聚類(lèi)(不含單序列)，得到代表序列再將其全部序列按照97%相似度比對(duì)到OTU上形成OTU列表(Caporasoetal., 2010)。使用Mothur軟件計(jì)算豐富度指數(shù)Chao1和多樣性指數(shù)Shannon(劉滿光等, 2018)。用FUNGuild數(shù)據(jù)庫(kù)解析赤松內(nèi)生真菌的營(yíng)養(yǎng)型類(lèi)別，置信水平僅選用probable和highly probable的OTUs及其類(lèi)別； 為避免擴(kuò)大功能類(lèi)別的指定，序列數(shù)小于3的OTUs將被刪除(Nguyenetal.， 2016)。使用R軟件(v2.15.3)繪制PCoA圖。測(cè)序數(shù)據(jù)已上傳NCBI，編號(hào)為SUB5584140。

2 結(jié)果與分析

2.1 操作分類(lèi)單元(OTU)及其多樣性

測(cè)序結(jié)果顯示，在赤松純林CC的12個(gè)樣品中共獲得內(nèi)生真菌有效序列405 240條，共計(jì)1 683個(gè)OTU。各樣品Coverage測(cè)序深度指數(shù)統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果見(jiàn)表1，結(jié)果顯示采集針葉樣本中覆蓋率均接近于99%，稀釋曲線平緩(圖1)，說(shuō)明各樣本中的真菌物種信息被充分檢測(cè)，結(jié)果能夠代表各類(lèi)針葉中內(nèi)生真菌的真實(shí)水平。

根據(jù)內(nèi)生真菌OTU數(shù)目，對(duì)樣品中OTU組成進(jìn)行分析，構(gòu)建Venn圖(圖2)和群落結(jié)構(gòu)柱狀圖(圖3, 4)。在赤松純林中不同染病程度的針葉中共有相同的OTU 223個(gè)，占OTU總數(shù)的13.25%，4類(lèi)針葉中特有的OTU數(shù)目分別為273、169、202、96個(gè)，以CC1中特有OTU數(shù)目最多。

樣本內(nèi)生真菌的Chao1指數(shù)和Shannon指數(shù)統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果見(jiàn)表1，無(wú)病斑赤松針葉內(nèi)生真菌的Chao1和Shannon指數(shù)最高，即測(cè)得OTU數(shù)與種類(lèi)數(shù)均最高，其次分別為染病赤松上的無(wú)病斑針葉、病斑長(zhǎng)度為針葉長(zhǎng)度2/1以下的赤松針葉、病斑長(zhǎng)度為針葉長(zhǎng)度2/1以上的赤松針葉。結(jié)果表明，隨著病害侵染的加重，內(nèi)生真菌豐富度及多樣性呈現(xiàn)出下降的趨勢(shì)。

表1 不同侵染級(jí)別的赤松針葉真菌豐度與多樣性Tab.1 Abundance and diversity of fungi in different level of disease in needles of P. densiflora

圖1 赤松樣品真菌OTU稀釋曲線Fig.1 OTU-based rarefaction curve of fungal communities in needles of P. densifloraCC1樣本包括P1、Q1、R1； CC2樣本包括P2、Q2、R2； CC3樣本包括P3、Q3、R3； CC4樣本包括P4、Q4、R4。 Samples of CC1 concludes P1, Q1, and R1; Samples of CC2 concludes P2, Q2, and R2; Samples of CC3 concludes P3, Q3, and R3; Samples of CC4 concludes P4, Q4, and R4.

圖2 不同感病級(jí)別赤松針葉OTU分類(lèi)的Venn示意Fig.2 Venn diagram of OTU distribution of fungi in different level of disease in needles of P. densiflora

2.2 真菌物種優(yōu)勢(shì)類(lèi)群組成

對(duì)1 683個(gè)OTU進(jìn)行物種歸類(lèi)，歸類(lèi)為28個(gè)門(mén)、205個(gè)屬。在門(mén)水平上(圖3)，子囊菌門(mén)(Ascomycota)占比最高，分別達(dá)到94.35%、91.85%、91.29%、97.13%，其次為擔(dān)子菌門(mén)(Basidiomycota)，分別占比3.17%、5.68%、2.25%和1.29%，子囊菌門(mén)為針葉內(nèi)生真菌中的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)。在屬水平上(圖4)，無(wú)病斑針葉CC1相對(duì)豐度較高的屬有多臂菌屬(Trichomerium)(5.52%)、暗色球菌屬(Phaeococcomyces)(4.25%)、煤炱目的一屬(Lapidomyces)(4.03%)、枝孢屬(Cladosporium)(3.62%)、煤炱目的一屬(Capnobotryella)(2.85%)、小穴殼科的一屬(Hormonema)(2.31%)，而染病赤松上的無(wú)病斑針葉CC2相對(duì)豐度較高的屬有暗色球菌屬(5.63%)、小穴殼科的一屬(Hormonema)(4.87%)、外囊菌屬(Taphrina)(4.69%)、煤炱目的一屬(Lapidomyces)(4.55%)、鏈格孢屬(Alternaria)(3.84%)、多腔菌屬(Myriangium)(3.50%)、煤炱目的一屬(Capnobotryella)(3.23%)、枝孢屬(2.73%)。在染病較輕針葉CC3中，相對(duì)豐度較高的屬有星裂盤(pán)菌屬(Phacidium)(10.31%)、小穴殼科的一屬(Hormonema)(7.98%)、截盤(pán)多毛孢屬(Truncatella)(5.90%)、暗色球菌屬(5.89%)、鏈格孢屬(5.51%)、圓盤(pán)菌屬(Orbilia)(3.66%)、座囊菌科的一屬(Rhizosphaera)(3.22%)、煤炱目的一屬(Lapidomyces)(3.08%)。而染病較重針葉CC4中屬有薄盤(pán)菌屬(Cenangium)(39.70%)、鏈格孢屬(11.73%)、小穴殼科的一屬(Hormonema)(10.62%)、散斑殼屬(Lophodermium)(4.70%)、座囊菌科的一屬(Rhizosphaera)(2.20%)、截盤(pán)多毛孢屬(1.83%)、枝孢屬(1.58%)。

圖3 不同侵染級(jí)別下赤松針葉真菌門(mén)水平組成Fig.3 Dominant fungal phyla from fungi of different level of disease in needles of P. densiflora

圖4 不同感病級(jí)別赤松針葉真菌屬水平組成Fig.4 Dominant fungal genera from fungi of different level of disease in needles of P. densiflora

2.3 真菌Beta多樣性

基于主坐標(biāo)分析樣品間多樣性差異，評(píng)估不同病級(jí)的赤松純林針葉內(nèi)生真菌的差異性(圖5)，結(jié)果表明，第一主坐標(biāo)PC1與第二主坐標(biāo)PC2的貢獻(xiàn)率分別為33.90%和18.10%，二者累積貢獻(xiàn)率為52.00%。無(wú)病斑針葉CC1和CC2相聚較近，而發(fā)病較輕的CC3和較重的CC4相聚較近，表明在枯梢病侵染的情況下，內(nèi)生真菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，無(wú)病斑針葉與染病針葉內(nèi)生真菌群落構(gòu)成差異明顯。

圖5 赤松針葉內(nèi)生真菌主坐標(biāo)分析Fig.5 Principal coordinates analysis of fungi in the needles of P. densiflora

2.4 真菌營(yíng)養(yǎng)型類(lèi)群

在FUNGuild的分析中，除去未歸類(lèi)的OTU，共有725個(gè)OTU在數(shù)據(jù)庫(kù)中成功注釋了營(yíng)養(yǎng)型功能信息。在共生營(yíng)養(yǎng)型的占比上，無(wú)病斑針葉CC1中最高(19.76%)，顯著高于其他3種針葉(均低于10%)，病理營(yíng)養(yǎng)型的分布以染病植株上的無(wú)病斑針葉CC2(26.37%)與染病較輕的針葉CC3(39.93%)較高，而腐生營(yíng)養(yǎng)型的占比上，4種針葉內(nèi)的占比均較高(依次為42.50%、38.00%、37.15%和65.87%)，其中染病較重的針葉CC4最高。真菌群落主要由單一營(yíng)養(yǎng)型構(gòu)成，兼顧2種或3種營(yíng)養(yǎng)型的菌類(lèi)在4種針葉中占比均較低。

圖6 赤松針葉內(nèi)生真菌群落營(yíng)養(yǎng)型比較Fig.6 Trophic composition of fungal communities in the needles of P. densiflora

3 討論

通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)，對(duì)純林內(nèi)的赤松針葉內(nèi)生真菌多樣性與群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析可知，針葉內(nèi)的真菌多樣性豐富，無(wú)病斑針葉與染病針葉優(yōu)勢(shì)門(mén)為子囊菌門(mén)和擔(dān)子菌門(mén)，無(wú)病斑針葉與染病針葉多樣性、群落結(jié)構(gòu)等方面均存在差異。

松枯梢病是針葉樹(shù)上最常見(jiàn)和分布最廣的重要病害之一。國(guó)內(nèi)對(duì)松枯梢病的研究在病原菌的多樣性、生物學(xué)特征等方面均有較大的進(jìn)展(劉秀嶶等, 2012; 陳潔等, 2019)，此外，近年來(lái)通過(guò)拮抗菌對(duì)病害的控制也取得了較多的成果(蔣萍等, 2007; 王鳳各等, 2016)，這些證實(shí)了可通過(guò)對(duì)寄主植物的微生物調(diào)控達(dá)到防控枯梢病暴發(fā)的目的。在其他植物內(nèi)生微生物的研究中，無(wú)病斑植物組織中的內(nèi)生真菌群落更加穩(wěn)定，而穩(wěn)定的群落結(jié)構(gòu)可抑制病原菌的入侵及繁衍。張麗娜等(2011)通過(guò)PDA平板培養(yǎng)法比較不同季節(jié)內(nèi)的無(wú)病斑山茶(Camelliapitardii)及感病山茶葉片內(nèi)生真菌群落的差異，發(fā)現(xiàn)無(wú)病斑葉片的內(nèi)生真菌數(shù)量、多樣性、均勻度高于染病葉片，證實(shí)染病程度顯著影響山茶葉內(nèi)生真菌多樣性。另有研究表明，2個(gè)品種染病后的內(nèi)生真菌變化趨勢(shì)也不同，高抗品種內(nèi)生真菌多樣性逐漸減少，而高感品種多樣性呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)(白維曉等, 2019)。有研究對(duì)漆樹(shù)(Toxicodendronvernicifluum)感染潰瘍病的枝干部?jī)?nèi)生真菌進(jìn)行培養(yǎng)，比對(duì)不同染病情況、不同部位的真菌多樣性結(jié)果表明，無(wú)病斑枝干的內(nèi)生真菌多樣性顯著高于受損傷組織，潰瘍病菌的侵染對(duì)內(nèi)生真菌群落結(jié)構(gòu)的影響顯著(Takemotoetal., 2014)。

本研究中，內(nèi)生真菌在無(wú)病斑針葉中表現(xiàn)為較高的多樣性，高于染病針葉，這與先前的研究結(jié)論一致。染病較重的針葉中多樣性指數(shù)顯著下降，是因?yàn)樵卺樔~的防御體系被破壞后，單一菌種的腐生營(yíng)養(yǎng)型真菌相對(duì)豐度較高的原因。在病原菌入侵植物組織時(shí)，寄主植物的防御機(jī)制被破壞，內(nèi)部平衡被打破，其他病原微生物以及腐生微生物更容易進(jìn)入植物組織內(nèi)(Steinruckenetal., 2016)。在無(wú)病斑棉花(Gossypiumhirsutum)和黃萎病侵染后的棉花根部的內(nèi)生真菌研究中，黃萎病侵染后的棉花根部?jī)?nèi)生真菌多樣性等指標(biāo)也均高于無(wú)病斑植株根部，證實(shí)病原菌的侵染提高了棉花內(nèi)部微生物的多樣性，并影響其群落結(jié)構(gòu)(劉政等, 2016)。

松屬樹(shù)種的針葉內(nèi)生微生物分析大都通過(guò)純培養(yǎng)法進(jìn)行研究，對(duì)樟子松(Pinussylvestrisvar.mongolica)、紅松(Pinuskoraiensis)等樹(shù)種的內(nèi)生真菌或內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行分離培養(yǎng)，初步證實(shí)了松針葉內(nèi)生微生物的多樣性及其中對(duì)內(nèi)生微生物多樣性的影響因素，如針葉葉齡(王立祥等, 2016)。在赤松內(nèi)生真菌研究中(Eoetal., 2018)，分離獲得了松生莖點(diǎn)霉菌(Sydowiapolyspora)、勃肯肉齒菌(Sistotremabrinkmannii)、殼針孢屬一種菌(Septoriapini-thunbergii)、春孔菌屬(Earliellasp.)和散斑殼屬菌(Lophodermiumspp.)等多株優(yōu)勢(shì)菌株。隨著對(duì)內(nèi)生微生物認(rèn)識(shí)的不斷提高以及研究水平的提升，第二代測(cè)序技術(shù)已經(jīng)常用于微生物多樣性的研究中。Bullington等(2015)對(duì)針葉樹(shù)種內(nèi)生真菌多樣性進(jìn)行了研究，對(duì)山白松(Pinusmonticola)針葉進(jìn)行接種，并通過(guò)新一代高通量測(cè)序手段對(duì)其中的內(nèi)生真菌多樣性和群落結(jié)構(gòu)的變化進(jìn)行測(cè)定，研究?jī)?nèi)生真菌相互間的種間競(jìng)爭(zhēng)、共生模式等，證實(shí)了接種真菌與潛在病原菌的相互競(jìng)爭(zhēng)。本研究結(jié)果得到內(nèi)生真菌的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)為子囊菌門(mén)。子囊菌門(mén)和擔(dān)子菌門(mén)均為常見(jiàn)植物內(nèi)生真菌(黃彩微等, 2018)，與先前赤松純培養(yǎng)內(nèi)生真菌研究(Eoetal., 2018)結(jié)論一致。

在無(wú)病斑植株的針葉與染病植株上的無(wú)病斑針葉的內(nèi)生真菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)在染病植株的無(wú)病斑針葉群落結(jié)構(gòu)已發(fā)生了變化。而在染病較重的針葉中的真菌群落組成中，薄盤(pán)菌屬為常見(jiàn)的松類(lèi)病害病原菌，該屬被證實(shí)與枯梢病病原菌的侵染具有緊密的聯(lián)系(Luchietal., 2014)。本研究通過(guò)群落營(yíng)養(yǎng)型分析揭示了該種變化，共生型營(yíng)養(yǎng)菌占比下降，而病理營(yíng)養(yǎng)型占比增高，其潛伏侵染病原菌的發(fā)病率增高。除染病較輕的針葉中病理營(yíng)養(yǎng)型pathotroph高于腐生營(yíng)養(yǎng)型，在無(wú)病斑與染病針葉中，腐生營(yíng)養(yǎng)型saprotroph均占有較高的比例，這與無(wú)病斑煙草的內(nèi)生真菌結(jié)構(gòu)一致(李朋發(fā)等, 2019)。病理營(yíng)養(yǎng)型真菌通過(guò)傷害寄主細(xì)胞來(lái)獲取自身所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，而腐生營(yíng)養(yǎng)型真菌通過(guò)分解死亡的寄主細(xì)胞來(lái)獲取營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)(Tedersooetal., 2014)。本研究中，染病較輕針葉中的病理營(yíng)養(yǎng)型真菌占比增高，說(shuō)明此時(shí)針葉中存在較高的致病菌，破壞針葉組織結(jié)構(gòu)，可導(dǎo)致其他類(lèi)真菌可對(duì)針葉進(jìn)行多重侵染。

4 結(jié)論

在赤松純林中，赤松針葉內(nèi)生真菌的多樣性及群落結(jié)構(gòu)組成受到枯梢病侵染的影響，多樣性及豐度均呈下降趨勢(shì)。無(wú)病斑針葉中內(nèi)生真菌的優(yōu)勢(shì)菌屬為多臂菌屬和暗色球菌屬，在染病后群落結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，無(wú)病斑針葉與染病針葉內(nèi)生真菌群落結(jié)構(gòu)差異顯著。腐生營(yíng)養(yǎng)型真菌在針葉中豐度均較高，共生營(yíng)養(yǎng)型真菌僅在無(wú)病斑植株的針葉上占一定比例，而在染病較輕針葉中病理營(yíng)養(yǎng)型真菌為主要真菌。