曾 杰，房海靈*，梁呈元*，亓希武，于 盱，李 莉，柏 楊，郭 強

(1.江蘇省中國科學院植物研究所，江蘇 南京 210014； 2.句容市虎耳山無花果專業(yè)合作社，江蘇 句容 212400 )

無花果(FicuscaricaL.)為?？?Moraceae)榕屬落葉小灌木，又稱映日果、奶漿果、蜜果等，是人類最早馴化栽培的果樹之一[1]。無花果果實肉質(zhì)甜糯，風味獨特，富含豐富的氨基酸、維生素、膳食纖維和多糖等成分，具有降血壓、抗衰老、抗癌、提高機體免疫力等功能[2-5]，深受廣大消費者的喜愛。這些年來，全國多地已陸續(xù)出現(xiàn)了種植無花果的熱潮[6]。然而，低溫卻成了制約無花果安全越冬的關(guān)鍵因子。因此，研究無花果品種的抗寒性，對于栽培地品種選擇，乃至耐寒品種的選育，都具有很重要的意義和價值。

目前，關(guān)于植物抗寒性的鑒定方法，主要有寒凍災(zāi)害調(diào)查法、生長恢復法、組織褐變法、生理生化指標測定法、組織細胞結(jié)構(gòu)觀察法等[7]，其中生理生化指標測定法具有用時短、不受氣候等條件限制等特點，已廣泛應(yīng)用于果樹、綠化樹種等植物(或作物)的抗寒性鑒定[8-9]。本研究擬對15個無花果品種進行人工低溫處理，通過測定低溫條件下它們的相對電導率、MDA等生理生化指標，利用模糊隸屬函數(shù)法綜合分析其抗寒性，為無花果引種地的品種選擇及耐寒品種的選育工作提供借鑒與基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

采自江蘇省中國科學院植物研究所無花果種質(zhì)資源圃中2年生健壯、無病蟲害、栽培管理措施一致的樹體，種質(zhì)名稱、來源等信息見表1。

表1 供試材料

1.2 試驗處理

于2019年12月取生長勢接近、粗細一致的1年生休眠枝條，用于抗寒性試驗。先用去離子水洗凈枝條，吸干水分，剪成長10 cm左右的枝段，石蠟封住2端。每10段為1組，每個品種分5組，于低溫冰箱中進行低溫處理，即1，-6，-13，-20，-27 ℃共設(shè)置處理5個，每個處理重復3次。處理組以7 ℃/h速度降溫，達到目的溫度后保持24 h，取出后于1 ℃條件下解凍12 h，進行相關(guān)指標的測定。

1.3 指標檢測

相對電導率測定：將低溫處理枝條剪成長0.3 cm的片段，稱取1 g置于50 mL試管，加入25 mL去離子水，于25 ℃搖床搖動90 min，測定初始電導率(R1)，隨后置于沸水浴中20 min，取出恢復室溫后測定其終電導率(R2)，計算相對電導率(%)，即(R1/R2)×100。

MDA，Pro，可溶性糖、可溶性蛋白含量均采用南京建成生物科技有限公司生產(chǎn)的試劑盒完成測定。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用Microsoft Excel 2010和SPSS22.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進行計算分析，其中以處理溫度x和相對電導率Y擬合Logistic方程Y=k/(1+ae-bx)，k=100代表細胞傷害率的飽和容量，求得擬合度R2和參數(shù)a，b，再根據(jù)LT50=lna/b得到低溫半致死溫度(LT50)[10]?？购跃C合指數(shù)采用模糊隸屬函數(shù)法綜合評價得到[11]。隸屬函數(shù)值Uij=(Xij-Xjmin)/(Xjmax-Xjmin)，反隸屬函數(shù)值=1-(Xij-Xjmin)/(Xjmax-Xjmin)，其中Xij為i品種第j個指標測定值，Xjmin和Xjmax為所有參試品種j指標最小測定值和最大值，j表示某抗寒指標。抗寒性綜合指數(shù)=(Uij+Uik…+Uin)/n，n為指標個數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫脅迫下無花果品種相對電導率及半致死溫度

植物受到低溫脅迫時易出現(xiàn)質(zhì)膜損傷現(xiàn)象，胞內(nèi)電解質(zhì)會發(fā)生不同程度的滲漏。因此，通常以電解質(zhì)外滲率作為評價植物受凍害程度的指標之一[12]。圖1表明，低溫下無花果各品種枝條的相對電導率出現(xiàn)3個階段的變化。在處理階段Ⅰ(1—-6 ℃)時，部分品種相對電導率出現(xiàn)下降趨勢。在處理階段Ⅱ(-6—-20 ℃)時，所有測試品種相對電導率急劇上升。在處理階段Ⅲ(-20—-27 ℃)時，部分品種相對電導率變化趨于平緩。其原因可能是，在低溫初期，部分品種細胞膜功能未受到損傷，可通過減少電解質(zhì)外運來降低冰點，以適應(yīng)低溫環(huán)境；隨著脅迫溫度進一步降低，質(zhì)膜損傷，導致大量電解質(zhì)滲漏，相對電導率急劇上升；達到極限溫度時，質(zhì)膜已受到不可逆損傷，電解質(zhì)外滲趨于緩慢。

圖1 低溫脅迫對無花果枝條相對電導率的影響

利用Logistic回歸方程，分析并計算供試無花果品種低溫半致死溫度LT50(見表2)。結(jié)果表明，Logistic回歸方程可較好地對低溫脅迫下無花果品種相對電導率與處理溫度的關(guān)系進行擬合，擬合度為0.816—0.996，達到顯著差異水平。15個品種LT50在-10.034—-17.538 ℃范圍內(nèi)，其中，抗寒能力最差的為尼祿，LT50為-10.034 ℃；抗寒能力最強的是波姬紅，LT50為-17.538 ℃；其后抗寒能力強弱依次為布蘭瑞克>灰山口>芭勞奈>斯特拉>路易斯安紫>青皮>瑪斯義陶芬>白蜜>綠喬丹>美麗亞>紫色波爾多>加州黑>阿爾瑪>尼祿。

表2 供試無花果品種的低溫半致死溫度(LT50)

2.2 低溫脅迫對無花果生理活性的影響

2.2.1 低溫脅迫對無花果MDA含量的影響 MDA是衡量植物逆境脅迫的重要指標，其含量的高低代表細胞受損程度[13]。由圖2可知，低溫處理下無花果各品種枝條中MDA含量均呈上升趨勢，且上升幅度具有品種差異性。處理溫度1—-6 ℃時，尼祿、路易斯安紫和芭勞奈等品種枝條中MDA上升趨勢較為緩慢，而其余品種則對早期低溫反應(yīng)較為靈敏，MDA含量急劇升高；處理溫度-6—-13 ℃時，白蜜、芭勞奈、波姬紅、綠喬丹、加州黑、阿爾瑪和尼祿中MDA含量上升幅度平緩外，其余品種均急劇上升；處理溫度-13—-20 ℃時，各品種MDA含量上升幅度不同，波姬紅、斯特拉、綠喬丹和尼祿等品種MDA含量急劇增加；在處理溫度-20—-27 ℃時，除瑪斯義陶芬、美麗亞、斯特拉和布蘭瑞克外，其余品種中MDA含量均急劇增加，表明細胞膜受到嚴重損傷。

圖2 低溫脅迫對無花果品種MDA含量的影響

2.2.2 低溫脅迫對無花果中游離脯氨酸含量的影響 低溫脅迫下，植物通過提高細胞內(nèi)游離脯氨酸(Pro)、可溶性蛋白和可溶性糖等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量，維持細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，進而減輕低溫對植物體的損傷。由圖3可見，低溫處理下無花果品種枝條中Pro含量均表現(xiàn)為一定的上升趨勢，表明各品種應(yīng)對低溫脅迫表現(xiàn)出積極的應(yīng)激反應(yīng)。尼祿和加州黑表現(xiàn)為Pro含量隨著脅迫溫度的降低呈先上升后降低的趨勢，在-20 ℃時達到最大值。分析原因可能是低于一定溫度時，植物體內(nèi)Pro合成受到阻礙造成含量下降；其他品種則表現(xiàn)為隨溫度降低而升高，芭勞奈、波姬紅和灰山口在-20—-27 ℃間急劇上升，可能是由于極低溫度對植物脯氨酸合成酶基因表達誘導，促進了脯氨酸的合成。阿爾瑪、綠喬丹、尼祿和加州黑Pro含量總體呈較低的水平，表明該類品種對低溫脅迫的應(yīng)激反應(yīng)較弱。

圖3 低溫脅迫對無花果品種Pro含量的影響

2.2.3 低溫脅迫對無花果中可溶性糖含量的影響 由圖4可見，多數(shù)無花果品種枝條中可溶性糖含量隨著處理溫度的降低而呈增高的趨勢，如瑪斯義陶芬、紫色波爾多、白蜜、芭勞奈、斯特拉、尼祿和青皮等品種在處理初期可溶性糖含量呈相對較低水平，之后隨著處理溫度的降低而穩(wěn)定上升，處理溫度-27 ℃時達到最高值；而灰山口、路易斯安紫、加州黑、青皮和阿爾瑪?shù)绕贩N則隨著處理溫度的降低表現(xiàn)為先升高后降低的趨勢，其原因可能是該類品種在極度低溫條件下，可溶性糖合成相關(guān)酶因低溫出現(xiàn)失活現(xiàn)象，影響了可溶性糖的合成；美麗亞和尼祿則表現(xiàn)出與以上2種不同的變化趨勢，即在隨著處理溫度的降低呈倒“M”變化，分析原因可能是可溶性糖是能量的來源，植物通過消耗可溶性糖來促進其他滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的合成，而其他滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)為可溶性糖的合成提供穩(wěn)定的環(huán)境，促進了其積累。

圖4 低溫脅迫對無花果品種可溶性糖含量的影響

2.2.4 低溫脅迫對無花果中可溶性蛋白含量的影響 可溶性蛋白具有較強的親水性，可作為滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)維持細胞滲透勢，降低冰點，增強植株耐寒性。由圖5可知，低溫脅迫下無花果品種枝條中可溶性蛋白含量變化趨勢與可溶性糖相似?，斔沽x陶芬、美麗亞、白蜜、波姬紅、路易斯安紫和加州黑等品種可溶性蛋白含量隨溫度降低而升高；灰山口和阿爾瑪則表現(xiàn)為先上升后下降趨勢；紫色波爾多、芭勞奈、斯特拉、綠喬丹、尼祿、布蘭瑞克和青皮等品種可溶性蛋白含量隨溫度升高先升高后下降再升高。尼祿和加州黑在整個處理溫度區(qū)間均表現(xiàn)為較低水平，表明該類品種抵御低溫的能力較弱。

圖5 低溫脅迫對無花果品種可溶性蛋白含量的影響

2.3 無花果品種抗寒性綜合評價

采用模糊隸屬函數(shù)法對相對電導率、MDA、Pro、可溶糖和可溶性淀粉等5個能反映無花果抗寒能力的指標進行分析，并計算平均值，其中Pro、可溶糖和可溶性淀粉函數(shù)值采用隸屬函數(shù)公式計算，相對電導率和MDA則采用反隸屬函數(shù)計算，結(jié)果見表3。按照隸屬函數(shù)值大小，對供試無花果品種的抗寒性進行排序，依次為波姬紅>布蘭瑞克>灰山口>斯特拉>芭勞奈>路易斯安紫>青皮>瑪斯義陶芬>白蜜>美麗亞>綠喬丹>阿爾瑪>紫色波爾多>加州黑>尼祿。

表3 無花果品種抗寒性指標隸屬度值及綜合指數(shù)

3 討論

低溫凍害是常見的自然災(zāi)害，一定程度上限制了植物的生長、發(fā)育及分布。研究表明，凍害可通過破壞生物質(zhì)膜結(jié)構(gòu)和功能對植株造成傷害。相對電導率是衡量膜透性的重要指標，值越高表示膜受損程度越嚴重。大量研究表明，植物在受到低溫脅迫時相對電導率變化呈先緩慢增加后急劇上升最后趨于平緩的“S”型曲線，且開始急劇上升時所處溫度因植物種類不同而各異，如桃為-21 ℃[10]，蘋果為-30 ℃[14]，火龍果為4 ℃[15]。本研究表明，大部分參試無花果品種在處理溫度為-6—-20 ℃間相對電導率呈激增狀態(tài)，表明無花果開始激增的溫度為-6 ℃。根據(jù)相對電導率計算所得的低溫半致死溫度被用來反映植物的抗寒性，并在多種植物如桃樹[10]、蘋果樹[14]、火龍果[15]等樹種中得到驗證。古麗尼沙·卡斯木等對無花果品種抗寒性進行研究，表明供試11個品種LT50均在-12.62 ℃以下[16]。本研究亦表明80.0%種質(zhì)枝條LT50在-15 ℃以下，與其起源于“古波斯和小亞細亞，即今天的土耳其、伊朗和敘利亞等地中海區(qū)域”相符[17]。

游離脯氨酸、可溶性蛋白和可溶性糖含量是衡量植物抗寒性的重要指標。研究表明，植物在低溫脅迫下會合成大量的游離脯氨酸、可溶性蛋白和可溶性糖等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)來保持細胞滲透勢水平，為膜內(nèi)物質(zhì)提供穩(wěn)定的環(huán)境，進而提高其對寒冷的適應(yīng)性[22]。李桂榮等[20]研究表明，低溫條件下葡萄中游離脯氨酸、可溶性蛋白和可溶性糖含量均有所提高。楊捷等[23]比較天目瓊花和花葉錦帶抗寒性發(fā)現(xiàn)，花葉錦帶可溶性蛋白和脯氨酸含量均高于天目瓊花，超過可承受的范圍時，出現(xiàn)下降趨勢，結(jié)合MDA等指標綜合評價認為花葉錦帶抗寒性強于天目瓊花。本研究結(jié)果亦發(fā)現(xiàn)，低溫誘導了無花果枝條中游離脯氨酸、可溶性蛋白和可溶性糖的合成以抵御低溫對細胞膜造成的損傷，極限低溫條件對部分品種可溶性糖和可溶性蛋白的合成具有抑制作用，該現(xiàn)象與張昕欣[24]在臘梅中的研究結(jié)果相似。分析原因可能是，第一， 極限低溫抑制了可溶性糖和可溶性蛋白合成相關(guān)酶的活性，使得可溶性糖和可溶性蛋白的合成減弱，從側(cè)面抑制了脯氨酸參與蛋白質(zhì)合成的過程，導致脯氨酸的大量積累[25]。第二，可溶性糖是植物的能源物質(zhì)之一，在極限低溫下植物需要消耗更多的能量來抵御冷害脅迫，從而引起可溶性糖含量的下降。此外，抗寒性較強的無花果品種中3種滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量上升幅度大，而抗寒性弱的品種則上升幅度較小，這與王孝宣等[26]和吳行昶[25]在番茄、葡萄中的研究結(jié)果相一致。

模糊隸屬函數(shù)法通過計算測定指標加權(quán)平均值來全面系統(tǒng)的反映評價指標，廣泛應(yīng)用于植物抗逆性評價[27-28]。翟新秘等[27]利用隸屬函數(shù)分析法評價玉米抗旱性，得出的抗旱評級與干旱處理后玉米表型結(jié)果一致。羅堯幸等[28]基于隸屬函數(shù)法對鮮食葡萄品種抗寒性進行評價，認為該方法優(yōu)于單一指標評價法，能夠全面反映葡萄實際抗寒能力。本研究采用隸屬函數(shù)法對無花果品種抗寒性進行評價，結(jié)果發(fā)現(xiàn)波姬紅的平均隸屬函數(shù)值最大(0.657)，抗寒性相對最強，與LT50結(jié)果相符；綠喬丹、阿爾瑪、紫色波爾多、加州黑和尼祿等品種平均隸屬函數(shù)值相對較低，表明其抗寒能力較弱。綜上可見，隸屬函數(shù)法能更為全面反映無花果品種的抗寒能力，可為無花果抗寒品種的選擇與育種提供一定的參考。