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        純水中解糖類芽孢桿菌的純化鑒定及其理化特性研究

        2020-10-17 05:39:54琳,陳
        黑龍江科學 2020年20期
        關(guān)鍵詞:實驗

        肖 琳,陳 中

        (華南理工大學食品科學與工程學院,廣州 510640)

        芽孢桿菌在微生物探討領(lǐng)域有著具大的作用。芽孢桿菌是工業(yè)上酶的重要菌種來源,利用芽孢桿菌通過發(fā)酵能產(chǎn)生具有高活性、高純度的淀粉酶、蛋白酶、纖維酶等[1,2]。木質(zhì)素是一種難降解的無定形芳香化合物,但經(jīng)鑒定表明,解糖類芽孢桿菌能降解纖維素和半纖維素,并能降解木質(zhì)素[3]。芽孢桿菌在農(nóng)作物的殺蟲防病和畜牧業(yè)上具有廣泛的應(yīng)用[4],它產(chǎn)生的多種功能代謝產(chǎn)物還具有抑菌和促生效果,還可應(yīng)用在研究生物保鮮和生物肥料等方面[5]?,F(xiàn)在很多飼料會添加益生菌。益生菌種類以芽孢桿菌、乳酸菌和酵母菌為主[6]。芽孢桿菌現(xiàn)已經(jīng)被應(yīng)用至醫(yī)學研究范疇。例如:大量實驗證明支氣管炎、腸炎等可利用枯草芽孢桿菌活菌劑來治療。此外,芽孢桿菌還可用于預防和治療皮膚細菌感染[7]。

        本實驗采用高溫純水中分離出來的菌株作為目標菌,對其進行鑒定和理化特性研究,對摸索其殺滅方式及對后續(xù)進行監(jiān)控具有一定的參考價值,也為開發(fā)此菌在各領(lǐng)域的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        1.1.1 主要設(shè)備

        分析天平/電子天平,振蕩器,恒溫培養(yǎng)箱,生物安全柜(博科生物生產(chǎn)),超凈工作臺,冰箱,生物顯微鏡,紫外分光光度計,高壓蒸汽滅菌器,pH計,過濾器,恒溫水浴鍋(上海精宏實驗設(shè)備有限公司生產(chǎn))。

        1.1.2 試劑與培養(yǎng)基

        R2A瓊脂培養(yǎng)基、TSA胰蛋白胨大豆瓊脂、LB培養(yǎng)基、MC 麥康凱瓊脂培養(yǎng)基(均為廣州市環(huán)凱生物科技有限公司生產(chǎn))。氧化酶試劑(生物梅里埃公司生產(chǎn)),氯化鈉(廣州化學試劑廠生產(chǎn)),API20E、API20NE、API50CH(生物梅里埃公司生產(chǎn)),細菌基因組DNA快速提取試劑盒(廣東東盛生物科技公司生產(chǎn))。

        1.2 方法

        1.2.1 菌株的采集、復蘇與保存

        純化水按藥典方法采用薄膜過濾法收集,通過R2A培養(yǎng)基培養(yǎng),TSA液體培養(yǎng)基中復蘇,劃板于TSA固體培養(yǎng)基平上,得到目標菌種。

        1.2.2 細菌形態(tài)觀察

        選取營養(yǎng)瓊脂平板上的24 h的新鮮菌落進行革蘭氏染色[8]和芽孢染色[9],于顯微鏡下觀察菌落的形態(tài)。

        1.2.3 生理生化鑒定

        A.運動性[10]。

        利用穿刺法蘸取新鮮菌落于斜面培養(yǎng)基上,放置于35℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24~48 h再觀察。如在培養(yǎng)基內(nèi)向邊緣擴散,則表示有運動性。

        B.氧化酶試驗[10]。

        將二甲基對苯二胺1%水溶液滴于干凈的濾紙上,挑取新鮮菌落于濾紙上,如果在10 s內(nèi)出現(xiàn)紅色為陽性,否則為陰性。

        C.AIP20 E、API20NE、API50CH生化試劑盒鑒定進行生化鑒定。

        D.16S rDNA鑒定。

        DNA提?。簠⒄誅NA快速提取試劑盒。

        DNA質(zhì)量檢驗:用超微量的分光光度計檢測 DNA的長度和濃度。

        PCR擴增:利用試劑盒對所提取的DNA通過聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)用來擴增基因片段[11]。委托廣東省微生物研究所完成。

        DNA序列的測定:將轉(zhuǎn)化好的菌液以1∶1的體積比加入50%的甘油,送往廣州華大基因科技有限公司進行測序,對比分析序列的同源性,確定其最終的種類。

        E.體外抑菌試驗。

        將新鮮培養(yǎng)好的菌懸液于8 000 r/min離心10 min,離心后取上清液濃縮至10 mL,作為待測液。準備五種致病指示菌(大腸桿菌ATCC25922、金黃色葡萄球菌ATCC25923、鼠傷寒沙門氏菌ATCC14028、內(nèi)志賀氏菌ATCC25931、乙型副傷寒桿菌CMCC50094)制備成菌懸液并均勻涂抹于LB培養(yǎng)基板上。在培養(yǎng)基平板中間打一小孔,孔內(nèi)注入100 μL制備好的芽孢桿菌待測液,置于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h,觀察是否有抑菌圈出現(xiàn)[12,13]。

        F.生長曲線的繪制。

        將新鮮菌株配置成濃度為108 CFU/mL菌懸液作為待測液。在裝有100 mL LB液體培養(yǎng)基的錐形瓶。加入2 mL的待測菌懸液,并編號,置于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h,每隔8 h取出錐形瓶,吸出1 mL菌懸液,用分光光度計測定培養(yǎng)基的OD600(細菌培養(yǎng)液在600 nm處的吸光值,利用吸光值來測量細菌培養(yǎng)液的濃度)。最后,將待測菌各個時間段的菌落OD值繪制成生長曲線[14,15]。

        G.耐膽鹽性實驗。

        膽鹽的主要成分是鈉鹽或鉀鹽,是動物膽汁中參與脂肪消化吸收的重要成分,具有殺菌功能[16]。配制膽鹽濃度分別為0.2%、0.5%、1%、2%、5%、8%、10%的LB培養(yǎng)基,接入等量的菌懸液,37℃和恒溫培養(yǎng)24 h,設(shè)未接菌的空白作對照。

        H.耐熱性實驗。

        將活化后的菌懸液分三次接種到LB液體培養(yǎng)基中,37℃培養(yǎng)4 h,將水浴鍋溫度依次設(shè)置為95℃、105℃、115℃。每個溫度段分別培養(yǎng)5 min、10 min、15 min和20 min,然后通過無菌操作吸收1 mL用高溫處理過的細菌溶液,快速冷卻,并在平板上計數(shù)。

        I.耐酸性實驗。

        因動物胃酸pH值大概在2.0~6.0,將菌懸液按5%的比例分別接種于不同pH的LB培養(yǎng)基中,培養(yǎng)基用HCl來調(diào)節(jié)pH值,并置于 37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng),分別2 h、4 h,吸1 mL并用MC培養(yǎng)基培養(yǎng)后計數(shù),重復三次[17-18]。

        動態(tài)顯色法檢測4種清熱解毒類中藥注射液中細菌內(nèi)毒素含量 …………………………………………… 張軍霞等(13):1806

        2 結(jié)果與分析

        2.1 菌落形態(tài)觀察

        觀察在TSA瓊脂平板上培養(yǎng)2 h的菌落后發(fā)現(xiàn),菌落蔓延擴散,呈油脂稍透明狀,圓形,菌落淡黃色,表面干燥,無固定大小,在營養(yǎng)瓊脂上無可溶性色素,如圖1。

        圖1 菌落Fig.1 Colony

        2.2 細菌形態(tài)觀察

        革蘭氏染色:通過染色將玻片放在40×100倍的顯微鏡下觀察。細菌革蘭氏染色陽性、桿狀,可見菌體內(nèi)膨大的芽孢囊。

        芽孢染色:在油鏡下觀察,菌體呈紅色,在膨大的胞囊內(nèi)芽孢呈綠色。

        2.3 生理生化鑒定結(jié)果

        通過運動性實驗發(fā)現(xiàn),細菌具有鞭毛,在培養(yǎng)基管內(nèi)觀察其具有一定的運動性。結(jié)合細菌的生理生化特性和菌落形態(tài),根據(jù)《伯杰氏細菌鑒定手冊》,可初步鑒定出該菌株屬于解糖類芽孢桿菌屬。菌株生理生化鑒定結(jié)果見表1。

        表1 菌株生理生化鑒定結(jié)果Tab.1 Physiological and biochemical identification results of the strain

        2.4 16S rDNA鑒定結(jié)果

        測序引物為1492R和27F。

        基因組序列:實驗菌株與對照條帶比較,可知目標擴增產(chǎn)物的片段長度大約為450 bp,則通過16S rRNA基因序列比對表明,該菌株與解糖類芽孢桿菌關(guān)系最密切,并結(jié)合生理生化反應(yīng)結(jié)果,將其鑒定為成解糖類芽孢桿菌。

        測序結(jié)果:中文名為解糖類芽胞桿菌(拉丁名Paenibacillus glucanolyticus)。

        2.5 體外抑菌試驗結(jié)果

        通過體外抑菌法進行對常見致病菌五種致病指示菌進行抑菌實驗,試驗結(jié)果如表2,說明解糖類芽孢桿菌對五種常見致病菌均有抑制作用。

        表2 解糖類芽孢桿菌抑菌性Tab.2 Bacteriostasis of bacillus amyloliquefaciens

        2.6 菌株生長曲線繪制

        從實驗可知,解糖類芽孢桿菌從培養(yǎng)至16 h后,吸光度OD600顯著上升,生長速度較快,進入對數(shù)增長期。菌株培養(yǎng)至24 h,OD600到達最高值,24 h后,曲線平緩下降,菌體進入穩(wěn)定生長期。32 h后,生長速度下降較快,菌體進入衰亡期。故在本實驗中,一般選取培養(yǎng)24 h菌齡的菌株為最適合接種菌株。

        2.7 耐膽鹽性實驗結(jié)果

        由表3可知,該菌株在2%以下鹽度的培養(yǎng)基中可生長。解糖類芽孢桿菌可以在低濃度鹽溶液中生長,具有一定的耐膽鹽性。

        表3 耐鹽性實驗結(jié)果Tab.3 Experimental results of salt tolerance

        2.8 耐熱性實驗結(jié)果

        從圖2中可看出,在95℃、105℃、115℃三個不同溫度下,加熱5 min后,細菌數(shù)量沒有減少,反而有少量增加,原因可能是時間短,液體傳熱速度慢,短時高溫反而促進孢子萌發(fā)。隨著加熱時間的延長,10 min后下降趨勢明顯。115℃和105℃熱處理20 min后,活菌數(shù)減少了2個數(shù)量級。95℃熱處理20 min后,僅減少了一個數(shù)量級。115℃隨著加熱時間增加,菌落減少較顯著,95℃和105℃熱處理曲線變化相對平緩,需要較長的加熱時間才能殺死相同數(shù)量的芽孢桿菌。

        圖2 菌株耐熱曲線Fig.2 The heat resistance curve of strain

        2.9 耐酸性實驗結(jié)果

        當初始pH值在2~6時,細菌數(shù)量隨pH值的變化而變化。當細菌處于強酸環(huán)境下(pH值為2和3)生長時,培養(yǎng)基的OD650值在0~14 h內(nèi)基本不變,約為0.3,說明解糖類芽孢桿菌在強酸性條件下生長性能差。在當初始pH為4時,OD650隨時間變化而呈上升趨勢,pH接近中性,OD650短時間內(nèi)接近OD650=1.7的時間越短,這說明,在弱酸性和中性環(huán)境下生長速度較快。因此,降低環(huán)境pH值的方法可用于抑制解糖類芽孢桿菌的生長。

        3 結(jié)論

        以生產(chǎn)用純水中分離出來的菌落作為目標菌株,通過生理生化鑒定及經(jīng)DNA基因測序?qū)⒕觇b定為解糖類芽孢桿菌。進一步對其理化性質(zhì)進行研究發(fā)現(xiàn),此芽孢桿菌具有一定的抑菌性,可應(yīng)用到動物飼料加工、食品防腐劑、生物防治等領(lǐng)域[19]。因為動物體內(nèi)的消化道環(huán)境非常復雜,如酸性環(huán)境的胃、含有膽鹽的腸道以及酶分解等作用,這些均是影響益生菌存活的關(guān)鍵因素。但解糖類芽孢桿菌具有耐酸性、耐膽鹽性以及耐高溫,利用這些優(yōu)勢,可以將其應(yīng)用至益生菌中[20]。本實驗通過對解糖類芽孢桿菌生理生化特性的初步研究,填補了此菌在這方面資料的空白。

        說明該菌抗菌譜較寬,對病原菌有一定的抑菌作用,在生物防治、醫(yī)藥衛(wèi)生和畜牧業(yè)等方面具有應(yīng)用潛力。

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