王苡瑄，殷 萌，韓穎妍，張小飛

(陜西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，陜西 咸陽 712046)

金花葵(Aureahelianthus) 為草本錦葵科植物，被廣泛用于食品、保健品、觀賞等方面[1]。金花葵在《本草綱目》中記載其具有消炎鎮(zhèn)痛功效?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究證明，金花葵花中所含有的總黃酮具有諸如鎮(zhèn)痛、治療心腦血管疾病和抗炎等多種功效[2]。目前，金花葵總黃酮提取工藝有四種，分別為有機(jī)回流法[3]、微波提取法、超聲波提取法以及酶解法[4]。前期有多篇文獻(xiàn)報(bào)道花類藥材采用超聲波提取具有提取率高、環(huán)保無污染、提取效率快等優(yōu)點(diǎn)，所以旨在單因素提取總黃酮的基礎(chǔ)上采用超聲提取方法[5]，對提取工藝作進(jìn)一步優(yōu)化。

1 實(shí)驗(yàn)材料、試劑與儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑

金花葵(河南省延津縣產(chǎn)，批號20180921)；蘆丁對照品(上海源葉生物科技有限公司生產(chǎn)，純度>96%，批號20180719)；無水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉均為分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

UV-2600紫外分光光度計(jì)(北京京科瑞達(dá)科技有限公司生產(chǎn))；AR1140分析天平(上海梅特勒-托利多儀器有限公司生產(chǎn))；KQ-400KDE型高功率數(shù)控超聲清洗機(jī)(上海比朗儀器制造有限公司生產(chǎn))；SHB-Ⅲ循環(huán)式多用真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司生產(chǎn))；DHG電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn))；RE5298A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠生產(chǎn))。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 標(biāo)準(zhǔn)對照液

精密稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品25 mg并將其加入到 100 mL容量瓶中，加入一定量的乙醇超聲溶解后定容，配置成標(biāo)準(zhǔn)對照液 (0.25 mg·mL-1)。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

采用劉琦等人的方法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[3]。測定不同濃度蘆丁溶液的吸光度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。最終得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：Y=4.790 9X+0.038 9，R2=0.995 2。

2.3 樣品測定

金花葵總黃酮粗品制備：將粉碎后金花葵花10 g加入250 mL70%的乙醇超聲溶解，抽濾旋蒸即得，按2.2項(xiàng)方法測定其吸光度。

式中，C為金花葵總黃酮濃度(mg/mL)；V為樣品的體積(mL)；N為其總的稀釋倍數(shù)；M為加入的金花葵重量(g)。

2.4 單因素實(shí)驗(yàn)

取金花葵粉末10 g于燒杯中，加乙醇溶解，倒入恒溫超聲提取機(jī)，超聲一定時(shí)間，抽濾、旋蒸，得金花葵總黃酮粗品?？疾斐暪β省⒓尤氲囊掖紳舛?、物料比三個(gè)因素對其總黃酮含量的影響。

2.5 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

分別以超聲功率(A)、加入的乙醇濃度(B)及金花葵總黃酮與乙醇溶液的物料比(C)作為考察因素，以金花葵花中總黃酮的含量為響應(yīng)面值。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、響應(yīng)曲面法因素編碼見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)因素水平及編碼Tab.1 Experimental factors level and coding

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

3.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1.1 超聲功率對總黃酮含量的影響

乙醇濃度選為70%、物料比為25∶1、提取溫度為10℃，超聲40 min，考察超聲功率對金花葵花中總黃酮含量的影響，結(jié)果如圖1所示。

圖1 不同超聲功率對超聲提取的影響Fig.1 Influence of supersonic extraction of different ultrasonic power

由圖1可得，在200～700 W內(nèi)總黃酮含量隨著功率增大而增大，而在700～800 W時(shí)隨著功率的增大金花葵花中總黃酮提取率逐漸減小。超聲功率達(dá)到700 W時(shí)，金花葵花中總黃酮提取率達(dá)到最大值，其隨著功率的升高，金花葵黃酮類物質(zhì)被提取與分離得越多，可功率繼續(xù)增大到一定程度則會產(chǎn)生雜質(zhì)而影響總黃酮的提取，所以確定最佳超聲功率為700 W。在響應(yīng)面試驗(yàn)中選擇超聲功率為600 W、700 W、800 W三個(gè)水平進(jìn)行了響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)。

3.1.2 乙醇濃度對總黃酮含量的影響

超聲功率700 W、物料比為25∶1、提取溫度為10℃，超聲40 min，考察乙醇濃度對金花葵花中總黃酮含量的影響，結(jié)果如圖2所示。

圖2 不同乙醇濃度對超聲提取的影響Fig.2 Influence of different ethanol concentration on supersonic extraction

由圖2可知，金花葵花中總黃酮提取的最佳乙醇濃度為70%。

3.1.3 物料比對總黃酮含量的影響

超聲功率700 W、乙醇濃度70%、提取溫度為10℃，超聲40 min，考察物料比對金花葵花中總黃酮含量的影響，結(jié)果如圖3所示。

圖3 不同物料比對超聲提取的影響Fig.3 Influence of different materials ratio on ultrasonic extraction

由圖3可知，物料比15∶1～25∶1時(shí)，金花葵總黃酮物質(zhì)含量隨物料比的增加而增加，當(dāng)物料比大于25∶1時(shí)，總黃酮物質(zhì)含量反而下降，這可能是因?yàn)辄S酮與乙醇相似相溶，隨著乙醇添加量的增加兩者發(fā)生協(xié)同效應(yīng)，有利于黃酮類物質(zhì)溶出。當(dāng)物料比為25∶1時(shí)，金花葵中的黃酮類物質(zhì)幾乎全部溶出達(dá)到飽和，此后繼續(xù)增加乙醇添加量，可能使其他物質(zhì)溶出，影響產(chǎn)品的純度。所以，在響應(yīng)面試驗(yàn)中選擇物料比為15∶1、25∶1、35∶1三個(gè)水平進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化的條件下，確定最終的最佳物料比為25∶1。

3.1.4 時(shí)間對總黃酮含量的影響

超聲功率700 W、物料比為25∶1、提取溫度為10℃，乙醇濃度為70%，考察超聲時(shí)間對金花葵藥材花中總黃酮含量的影響，結(jié)果如圖4所示。

圖4 不同時(shí)間對超聲提取的影響Fig.4 Influence of different time on ultrasonic extraction

由圖4可知，在提取時(shí)間20～40 min，金花葵花中總黃酮提取率逐漸增加，大于40 min后總黃酮提取率逐漸下降，這可能是因?yàn)樘崛r(shí)間過短，提取不徹底，金花葵中黃酮類物質(zhì)無法完全析出導(dǎo)致含量低。隨著時(shí)間的延長，在剪切力作用下使得金花葵粉末更加細(xì)膩，增加了其溶出速度。但當(dāng)超聲時(shí)間超過40 min后，可能其他雜質(zhì)成分溶出增加，導(dǎo)致其含量下降。所以，確定最終最佳的提取時(shí)間為40 min。

3.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果及回歸分析

3.2.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)分析

結(jié)果見表2。

3.2.2 回歸模型的建立及其分析

運(yùn)用Design-Expert 8.0.6.1軟件，對表2進(jìn)行擬合后，得到自變量超聲功率(A)、乙醇濃度(B)、物料比(C)與因變量總黃酮物質(zhì)含量(Y)的二次多項(xiàng)回歸方程為：

表2 超聲提取響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果Tab.2 Experiment and results of ultrasonic extraction response surface

Y=280.66+1.88A+9.08B+1.77C+2.71AB+0.21AC+4.80BC-11.83A2-37.51B2-17.47C2，檢驗(yàn)結(jié)果見表3。

模型方差分析見表3，其中模型的均方差P=0.001 7<0.05，表明該模型顯著；失擬項(xiàng)P值為0.633 8，無失擬項(xiàng)。結(jié)果顯示，影響顯著(P<0.05)的因素有：B-濃度、A2 、B2 、C2，各因素的P值反映各因素對響應(yīng)值的影響，P值越小，表明影響越大。

表3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)方差分析及顯著性檢驗(yàn)Tab.3 Analysis of variance and significance testing of response surface experiment

3.2.3 響應(yīng)曲面分析與優(yōu)化

響應(yīng)曲面圖是在因變量為總黃酮物質(zhì)含量的條件下各試驗(yàn)因素交互作用后得到的結(jié)果[6-7]。由圖5～7可知，3個(gè)單因素影響順序?yàn)椋阂掖紳舛?超聲功率>物料比。

圖5 物料比與超聲功率交互作用Fig.5 Interactive function of materials ratio and ultrasonic power

圖6 物料比與乙醇濃度交互作用Fig.6 Interactive function of materials ratio and ethanol concentration

圖7 乙醇濃度與超聲功率交互作用Fig.7 Interactive function of ethanol concentration and ultrasonic power

3.2.4 最佳提取工藝確定及驗(yàn)證試驗(yàn)

經(jīng)Design-Expert 8.0.6.1軟件計(jì)算分析，最佳工藝條件為：超聲功率為709.49 W、乙醇濃度為71.29%、物料比25.70∶1,在此條件下模型預(yù)測總黃酮物質(zhì)含量為281.392 mg/g。采用3次工藝驗(yàn)證其總黃酮含量為281.403 6 mg/g，驗(yàn)證結(jié)果較好，說明所擬合的模型方程可以較好地反映金花葵總黃酮的提取過程。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化篩選后,三個(gè)考察因素對金花葵中總黃酮物質(zhì)含量影響的大小順序?yàn)椤?提取溫度<功率<濃度。最佳工藝為超聲功率為709.49 W、乙醇濃度為71.29%、物料比為25.70∶1，3次平行驗(yàn)證試驗(yàn)的平均總黃酮物質(zhì)含量為281.403 6 mg/g，該實(shí)驗(yàn)為金花葵的提取及后續(xù)開發(fā)提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。