蔡新東，馬石霞，冉權(quán)，馬咸瑩，王致遠(yuǎn)，張海霞，丁功濤*

（1.西北民族大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730124；2.西北民族大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)研究中心，甘肅 蘭州 730030）

我國是畜禽養(yǎng)殖大國，每年都有大量的畜禽被宰殺。據(jù)國家統(tǒng)計(jì)局?jǐn)?shù)據(jù)可知，2019年，我國的生豬的出欄量超過7億頭，占世界總產(chǎn)量近50%；各類家禽出欄量超過130億羽；牛出欄量超過5500萬頭，羊出欄量超過2億頭[1]。畜禽血液是畜禽屠宰加工的主要副產(chǎn)物，我國每年畜禽屠宰所產(chǎn)生的血液總量可超過80萬噸，血液含有豐富的蛋白質(zhì)、維生素、微量元素、礦物質(zhì)等[2]。但是由于屠宰分散、技術(shù)落后、血液不易保存等原因，我國對(duì)畜禽血液的利用率還很低，每年屠宰的畜禽，只有1/4的血液進(jìn)行合理利用[3]，而絕大多數(shù)作為廢棄物進(jìn)行了排放，因而造成了嚴(yán)重的環(huán)境污染。

目前，我國利用畜禽血液生產(chǎn)生物制劑、蛋白飼料、添加劑、工業(yè)原料以及直接食用[4-5]。在生產(chǎn)生物制劑方面，主要用于生產(chǎn)一些血紅素鐵、血紅蛋白肽、血纖維蛋白原、凝血酶等醫(yī)療保健產(chǎn)品；在生產(chǎn)蛋白飼料方面，主要將畜禽血液作為原料，進(jìn)行發(fā)酵，陳宇等采用復(fù)合菌株對(duì)豬血進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵產(chǎn)品血腥味很淡，營養(yǎng)豐富，蛋白質(zhì)含量達(dá)到了69%，還含有多種游離氨基酸和微量元素[6]。張濱等采用多菌種發(fā)酵血液產(chǎn)品，得到的產(chǎn)物中可溶性蛋白含量達(dá)到20%以上，并產(chǎn)生了濃郁的香氣[7]。

利用蛋白酶，可以將血液蛋白降解為利于動(dòng)物消化吸收的多肽、小肽和氨基酸等。與游離氨基酸或全蛋白相比，動(dòng)物對(duì)二肽和三肽形式的蛋白質(zhì)吸收效率更高，并且二肽和三肽形式的蛋白質(zhì)可能會(huì)改善飲食成分的吸收[8-9]。因此，將血液蛋白酶解并制成動(dòng)物飼料，是解決廢棄血液的一個(gè)方向。本研究以無菌牛血為底物，用堿性蛋白酶酶解血液，通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)優(yōu)化酶解工藝參數(shù)，旨在為屠宰場處理廢棄血液提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

新鮮牦牛牛血（加入10%檸檬酸鈉抗凝，采于甘肅省臨夏州臨夏市枹罕鎮(zhèn)羅家堡村屠宰場），堿性蛋白酶（200000U/g，河南新仰韶生物科技有限公司），氫氧化鈉、鹽酸、鄰苯二甲酸氫鉀、硫酸、甲醛均為分析純，天津市百世化工有限公司。

1.2 方法

1.2.1 酶解溫度對(duì)牦牛血液蛋白水解度的影響

將牦牛血用蒸餾水稀釋成蛋白質(zhì)濃度為8%的溶血液[11]，在3%的酶濃度、pH為9.0、時(shí)間為5h、溫度分別為40℃、45℃、50℃、55℃、60℃的條件下進(jìn)行酶解，然后測定酶解溶液的水解度[10]。

1.2.2 酶濃度對(duì)牦牛血液蛋白水解度的影響

將牦牛血用蒸餾水稀釋成蛋白質(zhì)濃度為8%的溶血液，在pH為9.0、時(shí)間為5h、溫度為55℃、酶濃度分別為1%、2%、3%、4%、5%的條件下進(jìn)行酶解，然后測定酶解溶液的水解度[12]。

1.2.3 酶解時(shí)間對(duì)牦牛血液蛋白水解度的影響

將牦牛血用蒸餾水稀釋成蛋白質(zhì)濃度為8%的溶血液，在5%的酶濃度、溫度為55℃、pH為9.0、時(shí)間分別為2h、3h、4h、5h、6h的條件下進(jìn)行酶解，然后測定酶解溶液的水解度[13]。

1.2.4 pH對(duì)牦牛血液蛋白水解度的影響

將牦牛血用蒸餾水稀釋成蛋白質(zhì)濃度為8%的溶血液，在5%的酶濃度、溫度為55℃、時(shí)間為4h、pH分別為8、9、10、11、12的條件下進(jìn)行酶解，然后測定酶解溶液的水解

度[14]。

1.2.5 堿性蛋白酶水解血液蛋白的正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇酶解溫度、酶濃度、時(shí)間、pH作為試驗(yàn)因素，以血液蛋白水解度為指標(biāo)設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)[15]，采用L9（34）的正交試驗(yàn)表研究堿性蛋白酶酶解牦牛血液蛋白的各種因素對(duì)水解度的影響，各因素均取3水平，試驗(yàn)因素水平見表1。記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果，利用SPSS和Origin2016軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表

1.2.6 主要指標(biāo)測定方法

血液中總氮含量的測定：采用凱氏定氮法測定[16]。

式中：

X：試樣中蛋白質(zhì)的含量，單位為克每百克（g/100g）。

V1：試液消耗硫酸或鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定液的體積，單位為毫升（mL）。

V2：試劑空白消耗硫酸或鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定液的體積，單位為毫升（mL）。

c：硫酸或鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液濃度，單位為摩爾每升（mol/L）。

0.0140：1.0mL硫酸[c（1/2H2SO4）=1.000mol/L]或鹽酸[c（HCl）=1.000mol/L]標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液相當(dāng)?shù)牡馁|(zhì)量，單位為克（g）。

M：試樣的質(zhì)量，單位為克（g）。

V3：吸取消化液的體積，單位為毫升（mL）。

100：換算系數(shù)。

酶解液中氨基態(tài)氮含量的測定：采用甲醛電位滴定法測定[17]。

式中：

X：試樣中氨基酸態(tài)氮的含量，單位為克每百毫升（g/100mL）。

V1：測定用試樣稀釋液加入甲醛后消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的體積，單位為毫升（mL）。

V2：試劑空白實(shí)驗(yàn)加入甲醛后消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的體積，單位為毫升（mL）。

c：氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的濃度，單位為摩爾每升（mol/L）。

0.014：與1.00mL氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液[c（NaOH）=1.000mol/L]相當(dāng)?shù)牡馁|(zhì)量，單位為克（g）。

V：吸取試樣的體積，單位為毫升（mL）。

V3：試樣稀釋液的取用量，單位為毫升（mL）。

V4：試樣稀釋液的定容體積，單位為毫升（mL）。

100：單位換算系數(shù)。

水解度的計(jì)算：水解度（%）=（氨基酸態(tài)氮/樣品中總氮）×100[18]。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度對(duì)血液蛋白水解度的影響

由圖1可知，當(dāng)溫度從40～55℃時(shí)，水解度隨著溫度的升高而不斷加大；當(dāng)溫度從55～60℃時(shí)，水解度隨溫度的升高而降低，且在55℃下出現(xiàn)最大水解度，故55℃設(shè)定為正交試驗(yàn)的酶解溫度。溫度升高時(shí)，酶的催化速度加快，但酶蛋白變性失活的速度也在不斷增加，同時(shí)過高的溫度也會(huì)使底物蛋白發(fā)生變性，影響酶的催化速度[19]。

2.2 酶濃度對(duì)血液蛋白水解度的影響

由圖2可知，當(dāng)酶濃度從1%～5%時(shí)，水解度隨著酶濃度的升高而不斷加大；當(dāng)酶濃度大于5%時(shí)，水解度反而降低，故將5%設(shè)定為正交試驗(yàn)的酶濃度添加量。酶濃度直接影響酶解過程的效率，酶濃度的增加一般可提高蛋白質(zhì)的水解度，但當(dāng)酶濃度大于最適濃度時(shí)，其作用效果不會(huì)明顯提高，甚至引起酶自溶增強(qiáng)，從而不利于酶解[20]。

2.3 時(shí)間對(duì)血液蛋白水解度的影響

由圖3可知，隨著酶解時(shí)間的延長，水解度不斷提高；當(dāng)時(shí)間超過4h時(shí)，水解度上升的不明顯，甚至略微下降，故4h設(shè)定為正交試驗(yàn)中的酶解時(shí)間。酶解時(shí)間的延長能提高血液蛋白的水解度，但長時(shí)間的酶解過程中，酶會(huì)將氨基酸降解為生物胺類物質(zhì)，導(dǎo)致游離氨基態(tài)氮含量降低[21]。

2.4 pH對(duì)血液蛋白水解度的影響

由圖4可知，pH7-11時(shí)，隨著pH值增大，血液蛋白的水解度先升高后逐漸降低，當(dāng)pH為9時(shí)，水解度最高，故將9設(shè)定為正交試驗(yàn)的pH值。pH值可改變酶與底物的荷電狀態(tài)，從而影響酶的活性。酶的最適pH值受酶的純度、底物的種類和濃度、緩沖劑的種類和濃度及抑制劑等因素的影響[22]。

2.5 堿性蛋白酶水解血液蛋白正交試驗(yàn)和極差分析結(jié)果

堿性蛋白酶水解血液蛋白正交試驗(yàn)和極差分析結(jié)果見表2。極差分析結(jié)果表明，時(shí)間對(duì)酶解液的水解度影響較大，各因素對(duì)水解度影響程度依次為時(shí)間、溫度、酶濃度、pH值。從K值可知較佳的工藝條件是A2B3C3D2，即酶解溫度55℃、酶濃度6%、時(shí)間5h、pH9.0，此條件下，血液蛋白的水解度可達(dá)21.32%。

表2

3 結(jié)語

本研究以無菌牛血為原料，利用堿性蛋白酶進(jìn)行牛血的酶解工藝研究，以水解度為指標(biāo)，對(duì)酶解工藝中的溫度、酶濃度、時(shí)間和pH進(jìn)行單因素試驗(yàn)，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行正交優(yōu)化試驗(yàn)，得到優(yōu)化的酶解工藝條件為溫度55℃、酶濃度6%、時(shí)間5h，pH9.0，此時(shí)的水解度為21.32%。本研究探索了堿性蛋白酶水解血液蛋白的優(yōu)化酶解條件，為廢棄血液蛋白的處理提供了參考。